[发明专利]一种生物转化柚皮素获取圣草酚的方法

摘要

本发明公开了一种生物转化柚皮素获得圣草酚的方法，该方法首先制备共表达重组大肠杆菌，然后对该重组大肠杆菌的前培养和扩大培养，收集菌体后用于对柚皮素进行生物转化；本发明采用重组大肠杆菌转化株转化柚皮素，定向生成单一的化合物圣草酚，减少了产物的混杂性，同时也简化了分离萃取产物的步骤，降低了获得圣草酚的难度。

主权项

一种生物转化柚皮素获取圣草酚的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备共表达重组大肠杆菌：用Nde I和Spe I酶切阿维链霉菌MA4680的编码CYP105D7的sav7469基因和载体pT7NS‑camAB，并进行连接获得重组载体pET11::sav7469::camA‑camB，将重组载体导入到大肠杆菌BL21(DE₃)中，最终获得共表达重组大肠杆菌；所述阿维链霉菌MA4680的编码CYP105D7的sav7469基因的基因序列如SEQ ID NO.1所示，载体pT7NS‑camAB的基因序列如SEQ ID NO.4所示，重组载体pET11::sav7469::camA‑camB的基因序列如SEQ ID NO.5所示；(2)重组大肠杆菌的前培养和扩大培养：将重组大肠杆菌加入LB培养基中，在pH为7.4‑7.6范围内，温度为37℃、转速为200rpm条件下培养18小时，得重组大肠杆菌的种子液；将重组大肠杆菌的种子液接种到M9培养基中进行扩大培养、发酵；种子液和M9培养基的体积比为1:100，接种后，重组的大肠杆菌继续在37℃、培养至菌液OD₆₀₀值达到0.6～0.8左右，然后加入IPTG和5‑氨基乙酰丙酸盐诱导菌体大量表达蛋白，IPTG的终浓度为0.1mM，5‑氨基乙酰丙酸盐的终浓度为0.5mM；再将温度降低至22℃，转速降低为150rpm，继续培养20h；(3)菌体的收集：在4℃，3000rpm条件下离心10min，收集沉淀的菌体；并采用4℃的磷酸钠缓冲液对菌体进行洗涤两次，收集洗涤后的菌体，并将其悬浮于磷酸钠缓冲液中，得到反应液，用于对柚皮素进行生物转化；(4)柚皮素的生物转化：将柚皮素溶解在甲醇后，添加到步骤3中得到的反应液中进行生物转化，得转化液；柚皮素的终浓度为0.15mM，生物转化的条件为150rpm、30℃的条件下培养6h；待反应结束后，加入与转化液等量的乙酸乙酯停止反应，乙酸乙酯和转化液充分混合使产物全部进入到乙酸乙酯有机相中，混合物震荡2min，将混合液12000rpm离心5min，收集上清液；对上清液进行干燥得到圣草酚。