[发明专利]一种金针菇种内原生质体融合方法

摘要

本发明公开了一种金针菇种内原生质体融合方法，它包括以下步骤：分离原生质体、标记原生质体、原生质体融合、再生培养融合子和菌种繁殖，标记原生质体步骤包括热灭活标记和化学灭活标记。本发明通过对金针菇分离原生质体、标记原生质体、原生质体融合、再生培养融合子和菌种繁殖，提供了一种金针菇种内原生质体融合方法，该方法解决了传统金针菇育种变异幅度大、筛选工作量大、周期长的缺点，采用本发明方法标记的原生质体稳定，获得原生质体融合子数量多，本发明方法操作简单、周期短、成本低、适用于快速选育优良品种。

主权项

一种金针菇种内原生质体融合方法，其特征在于，它包括以下步骤：S1. 分离原生质体：取亲本金针菇的菌丝体3～5g放入三角瓶中，加入原生质体分离酶制剂10ml，在25～32℃下放置3～4h，用无菌G2漏斗过滤收集滤液于离心管中，4500～5500rad/min的转速离心8～12min，去上清液，离心管中加入10ml 0.6mol/L的硫酸镁，即为亲本原生质体悬浮液；所述分离酶制剂为溶壁酶溶液，用无菌0.6mol/L的硫酸镁溶液稀释而成；S2. 标记原生质体：S21. 热灭活标记：将装有亲本之一原生质体悬浮液2～3 ml的离心管放入55～65℃的水浴锅中进行热灭活处理3～5min，即为热灭活的原生质体；S22. 化学灭活标记：将装有另一亲本原生质体悬浮液2～3 ml的离心管中加入质量分数为1.5～2%的甲磺酸乙酯1ml，在25～35℃的温度下处理1～2h，4500～5500rad/min的转速离心10min，去除上清液，在离心管内加入2～3ml 0.6mol/L的硫酸镁，即为化学灭活的原生质体；S3. 原生质体融合：将热灭活的原生质体和化学灭活的原生质体混合，离心机离心去除上清液，离心管中加入融合剂2ml，30～35℃水浴中温育8～15min，再次离心去除上清液，加入4ml 0.6mol/L的硫酸镁渗透压稳定剂，即为原生质体融合混合液；其中，所述离心机的转速为1500～2500rad/min，离心时间为15～25min；S4. 再生培养融合子：取步骤S3制备的原生质体融合混合液100μl，接种在再生培养基上，20～25℃下培养10～15d；S5. 菌种繁殖：在再生培养基上萌发的菌落中取单个菌落，接种在菌种繁殖培养基上培养，所述培养的条件为：培养温度20～25℃，培养时间6～10d，即为金针菇原生质体融合子。