[发明专利]一种诱导长茄游离小孢子愈伤组织的形成及植株再生方法

摘要

本发明涉及一种诱导长茄游离小孢子愈伤组织的形成及植株再生方法，取花蕾进行消毒处理，然后分离出花蕾中的小孢子，在35‑36℃下进行热激处理，然后在液体培养基中进行黑暗静止培养，经过2次添加培养基和分皿，当愈伤组织块径长到2cm时转到分化培养基上，同时加液体培养基形成固液共培养，60d后分化出芽点，当芽点长到2‑3cm即从愈伤组织上分离，转入过渡培养基上继续培养，之后转入1/2MS培养基进行生根培养，15‑20天分化出发达根系，形成完整植株。本方法获得的完整植株的机率较高，小孢子成功诱导成愈伤组织的概率较大，且经过渡培养基处理过的芽点生根较快，根系较发达，大大加快了茄子的育种进程。

主权项

一种诱导长茄游离小孢子愈伤组织的形成及植株再生方法，其特征在于：取花蕾进行消毒处理，然后分离出消毒过的花蕾中的小孢子，在35‑36℃下进行热激处理，然后在液体培养基中进行黑暗静止培养，15‑20d后陆续出现肉眼可见的愈伤组织，当愈伤组织块径长到2mm时转到分化培养基上，同时加入1‑2ml液体培养基形成固液共培养，60d后分化出芽点，当芽点长到2‑3cm即从愈伤组织上分离，转入过渡培养基上继续培养，10‑15d后转入1/2MS培养基进行生根培养，15‑20d分化出发达根系，形成完整植株；具体方法包括如下：（1）花蕾的选取与消毒:选取花萼微张、未裂开、花药绿白色或黄绿色的花蕾，20‑25朵花蕾在加入200μl吐温和50ml 8wt.%次氯酸钠的混合溶液中振荡消毒15min，在无菌条件下用无菌水冲洗3‑4次，用无菌滤纸吸干水分备用；（2）小孢子分离与收集: 将已消毒的花蕾剥取花药于研钵中，取20‑25朵花蕾的花药集中在一个研钵中，加入2ml 91g/L甘露醇的洗液，用研杵挤压花药，然后再加入8ml洗液，用200目无纺布过滤于带盖离心管，1000r/min离心3分钟，弃上清液，收集沉淀，再加入10ml 91g/L甘露醇的洗液重悬，1000r/min离心3分钟，再加入洗液洗涤沉淀2次；（3）小孢子的愈伤组织诱导及培养过程：用热激培养基1将分离的小孢子稀释到1.0×105 个/ml，吸取3‑4ml于直径6cm培养皿中，封口，35‑36℃黑暗静止培养；培养3‑5天后培养皿加入等体积液体培养基2，然后均分成2皿，封口，在25℃下继续黑暗静止培养；培养4‑7天后每皿再添加等体积液体培养基3，然后每皿均分成2皿，封口，继续在25℃黑暗静止培养，7‑10天后形成肉眼可见的愈伤组织；（4） 愈伤组织分化培养：当愈伤组织长到2mm，转移到分化培养基上，每瓶4‑5个愈伤组织，采用固液共培，即每瓶加入1‑2ml液体培养基3，然后在3000‑5000Lx光照，12‑14h·d‑1条件下培养，20天继代一次，培养60天分化出芽；（5）过渡培养：当芽长到2‑3cm时即从愈伤组织上分离，转入过渡培养基上培养10‑15天；（6）生根培养：转入1/2 MS培养基中进行生根培养，15‑20天分化出发达根系，形成完整植株；所述的热激培养基1包含以下成分：1.5 NLN培养基中添加甘露醇80‑100 g·L–1 、水解酪蛋白130‑170mg·L–1、2, 4‑D 0.1‑1mg·L–1 、NAA 0.1‑1 mg·L–1、6‑BA 0.1‑1 mg·L–1；所述液体培养基2包含以下成分：1.5 NLN培养基、蔗糖50‑70g· L–1 、水解酪蛋白130‑170mg· L–1、2,4‑D 0.1‑1mg·L–1 、NAA 0.1‑1 mg·L–1、6‑BA 0.1‑1 mg·L–1；液体培养基3包含以下成分：1.5 NLN培养基、蔗糖20‑40g· L–1 、水解酪蛋白130‑170mg·L–1、2,4‑D 0.1‑1mg·L–1 、NAA 0.1‑0.5 mg·L–1、6‑BA 0.1‑0.5 mg·L–1；所述分化培养基包含以下成分：MS培养基、蔗糖20‑40 g·L–1 、琼脂5‑8 g·L–1 、NAA 0.001‑0.01mg·L–1、ZT 0.5‑1.5mg·L–1；所述过渡培养基包含以下成分：MS培养基、蔗糖20‑40 g·L–1 、琼脂5‑9 g·L–1 、活性炭0.5‑1.5wt.%、NAA 3‑7 mg·L–1、IAA 0.1‑1mg·L–1。