[发明专利]一种大鼠脑垂体细胞的分离及培养方法

摘要

本发明提供了一种大鼠脑垂体细胞的分离及培养方法，包括以下步骤(1)选取8d的雄性SD大鼠，麻醉处死；(2)将大鼠麻醉后腹面向上固定于板上，无菌条件下取出大鼠脑垂体，将脑垂体放入预冷PBS液中洗涤数次除去血渍，去除垂体包膜；(3)无菌条件下，在预冷的PBS中用眼科剪将脑垂体剪成1mm×1mm碎块；(4)用预热的III型胶原酶结合中性酶混合消化；(5)终止消化，过滤，收集滤液离心，弃上清，加培养基重悬，重复操作三次；(6)接种到24孔培养板培养；(7)将培养7d的细胞经胰酶消化后再次筛网纯化，离心弃上清，重悬接种于处理后的培养板中；(8)细胞免疫荧光鉴定。本发明提供的一种大鼠脑垂体细胞的分离及培养方法，操作简单，所得脑垂体细胞存活率高、活性好，可用于建立体外实验模型细胞，满足脑垂体细胞实验的要求。

主权项

一种大鼠脑垂体细胞的分离及培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)选取8d的雄性SD大鼠，腹腔注射30mg/ml的戊巴比妥钠麻醉；(2)将大鼠麻醉后腹面向上固定于板上，局部常规消毒，用眼科剪剪去大鼠颈部被毛，无菌条件下十字切口，取出大鼠脑垂体，将脑垂体放入预冷无菌含双抗PBS液中洗涤数次除去血渍，去除垂体包膜；(3)无菌条件下，在预冷的PBS中用眼科剪将脑垂体组织剪成1mm×1mm的碎块；(4)用37℃预热的III型胶原酶结合中性酶混合消化；(5)用含大鼠血清、双抗、胰岛素的混合培养基(简称混合培养基)终止消化，用吸管反复吹打，收集脑垂体细胞悬液用300～500钼网筛过滤，所得滤液80～150g离心6分钟，去掉上清液，加入15ml的混合培养基并用吸管吹打，重复上述操作3次；(6)用细胞计数板计数，再将细胞密度调至1×105个/ml，接种至铺多聚赖氨酸包被的的24孔培养板中，置于37℃、5％CO2环境中培养，5h后贴壁，2d后换体积分数为5％大鼠血清DMEM/F12培养基培养，4d后换体积分数2.5％大鼠血清DMEM/F12培养基培养，5d后换无血清培养基培养，每24h观察细胞的生长状况及形态变化；(7)将培养7d的细胞经胰蛋白酶消化3～6分钟后再300～500钼筛网纯化，300～400g离心5分钟弃上清，所得细胞沉淀用培养基重悬后接种于处理后的培养板中；(8)体外培养4～5d，细胞免疫荧光鉴定。