[发明专利]山羊骨骼肌卫星细胞的分离纯化方法

摘要

本发明公开了山羊骨骼肌卫星细胞的分离纯化方法，包括山羊骨骼肌卫星细胞的分离和山羊骨骼肌卫星细胞的纯化两大步骤。本发明采用胰蛋白酶消化和组织块法相结合进行骨骼肌卫星细胞的分离，在细胞传代时继续进行差速贴壁法进行山羊骨骼肌卫星细胞的纯化，并通过后期传代过程中连续5代以上继续采用差速贴壁法进行山羊骨骼肌卫星细胞的纯化，得到了纯度更高的骨骼肌卫星细胞。

主权项

山羊骨骼肌卫星细胞的分离纯化方法，包括以下步骤：(1)采集山羊肌肉组织，先用酒精清洗消毒，再用生理盐水冲洗后放入DMEM/F12培养基中，于12h之内进行骨骼肌卫星细胞的分离；(2)用含有青霉素和链霉素的生理盐水冲洗肌肉组织，将其剪成0.5×0.5cm的大组织块；(3)将获得的大组织块放入培养皿中，加入0.25％胰蛋白酶‑EDTA进行消化，保证胰蛋白酶能够完全没过大组织块，4℃条件下静置12h，加入增殖培养基终止消化；之后将培养皿中的大组织块连同培养液转移至50ml的离心管内，1000r/min离心8min，吸除上清液，再用增殖培养液重悬，用无菌吸管将大组织块及培养液转移至培养皿中；(4)将步骤(3)得到的大组织块再剪成0.5～1mm³的小组织块，再加入适量的增殖培养液，将小组织块均匀地铺开在培养皿中，各小组织块之间的间距在3mm，吸去培养基，待小组织块充分吸附于培养瓶后，再把培养瓶翻转过来观察小组织块是否充分吸附于培养瓶上，再慢慢加入预热至37℃的培养液，重新置于细胞培养箱中进行原代培养，每日在倒置显微镜下观察细胞形态和生长情况，每两天更换培养液；待细胞长至80％～90％汇合度时，吸去培养瓶中旧培养液，用预热至37℃的PBS清洗细胞，以去除残余的血清和组织块及死细胞，重复2次，从而得到未纯化的山羊骨骼肌卫星细胞；(5)采用差速贴壁法进行原代山羊骨骼肌卫星细胞的纯化：首先将步骤(4)得到的未纯化贴壁细胞用DPBS洗涤3次，胰酶消化3min，加入2倍体积增殖培养液终止消化；1500r/min离心7min，收集细胞，加入增殖培养液重悬；按5×10⁴～8×10⁴个接种至事先包被有明胶的培养皿上培养1h，当有大量细胞贴壁时取上层未贴壁的悬浮细胞重新接种至新的培养皿上，此时贴壁的细胞主要为成纤维细胞，由于骨骼肌卫星细胞的贴壁速度较慢，此步骤重复2～3次，第4天换液，去除血细胞及未贴壁的死细胞，并观察细胞生长情况，此后连续5天进行骨骼肌卫星细胞的纯化。