[发明专利]鉴定番茄叶霉病抗性的高通量分子标记及其标记方法与应用

摘要

本发明公开了鉴定番茄叶霉病抗性的高通量分子标记及其标记方法与应用,分子标记为根据目的基因关键特异性位点设计引物Cf‑5‑Al lele‑F1、引物Cf‑5‑Al lele‑F2和引物Cf‑5‑R，利用引物末端碱基特异匹配对目的基因进行基因分型；本发明采用PCR的SNPLine平台是高通量的分子标记系统，所以能实现操作流程全自动，降低人为误差；分析通量高，每天可完成五十万个SNP基因型分型，适合大量样品同时检测。基于番茄叶霉病抗病基因Cf‑5设计的高通量检测的KASP分子标记，并应用于番茄叶霉病抗病植株的高通量筛选与鉴定，可以大大节约时间和人工成本，提高分子标记辅助选择的育种效率，对培育抗叶霉病的番茄优良品种、有效控制番茄叶霉病的危害，具有重要意义，也是一项重要的育种方法创新和技术创新。

主权项

1.鉴定番茄叶霉病抗性的方法，其特征在于：所述方法是通过利用分子标记的引物对番茄全基因组DNA进行PCR扩增和鉴定实现的；所述分子标记的引物为：Cf‑5‑Allele‑F1：5’‑GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCTGAAATCATGTTTCCTGATCTT‑3’；Cf‑5‑Allele‑F2：5’‑GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCTGAAATCATGTTTCCTGATCTC‑3’；Cf‑5‑R：5’‑CTTAGATTTCCAGTCGAGATCAAG‑3’；所述方法包括以下步骤：a使用CTAB法提取番茄全基因组DNA；b利用所述的引物Cf‑5‑Allele‑F1、引物Cf‑5‑Allele‑F2和引物Cf‑5‑R以番茄全基因组DNA为模板进行PCR扩增；所述PCR扩增的体系为KASP基因分型PCR反应体系，所述KASP基因分型PCR反应体系为：5ngDNA，0.07μl KASP 72×assay mix，2.5μl KASP V4.02×Master Mix，将上述三种物质混合，加ddH₂O至5μl；其中，KASP72×assay mix由浓度为100μM的引物Cf‑5‑Allele‑F1、引物Cf‑5‑Allele‑F2和引物Cf‑5‑R与ddH₂O按12︰12︰30︰46的体积比混合得到；KASP V4.02×Master Mix由荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B，高保真酶和dNTP组成；其中，荧光探针A为：在5’‑GAAGGTGACCAAGTTCATGCT‑3’的5’末端连接1个FAM荧光基团；荧光探针B为：在5’‑GAAGGTCGGAGTCAACGGATT‑3’的5’末端连接1个HEX荧光基团；淬灭探针A为：在5’‑AGCATGAACTTGGTCACCTTC‑3’的3’末端连接淬灭基团BHQ；淬灭探针B为：在5’‑AATCCGTTGACTCCGACCTTC‑3’的3’末端连接淬灭基团BHQ；c对PCR扩增产物进行荧光扫描；d分析等位基因分型结果。