[发明专利]重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达、纯化以及活性鉴定方法

摘要

本发明公开了一种重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达、纯化以及活性鉴定方法，该诱导表达以及纯化方法包括：1)重组表达质粒的构建：设计带有EcoR I和Not I酶切位点Lunasin序列，并设计特异性扩增引物，进行PCR扩增获得目的基因片段；2)筛选高抗性重组基因工程菌株；3)重组luansin多肽的发酵生产；4)重组luansin多肽的分离纯化：得到纯度为93％的重组lunasin多肽。本发明首次提出使用毕赤酵母表达系统制备lunasin多肽，通过基因工程的方法使luansin多肽的规模化生产可以得以实现。毕赤酵母表达lunasin多肽成本低，产量高，分立纯化步骤简单。

主权项

一种重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达以及纯化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)重组表达质粒的构建设计带有EcoR I和Not I酶切位点Lunasin序列，并设计特异性扩增引物，进行PCR扩增获得目的基因片段，将目的基因片段用限制性内切酶EcoR I酶和Not I酶进行双酶切，然后将用相同限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切的质粒pPIC9K与酶切后的PCR扩增产物用T4DNA连接酶连接，通过热激转化到大肠杆菌DH5α中培养扩增，提取得到重组表达质粒pPIC9K‑lunasin；2)筛选高抗性重组基因工程菌株将重组表达质粒pPIC9K‑lunasin经Sac I线性化酶切，将经酶切线性化的重组表达质粒与感受态毕赤酵母GS115细胞按比例混合后，进行电击转化获得转化子，将转化子分别接种于MM培养基和MD培养基，经过PCR鉴定及G418高抗性筛选，阳性克隆为重组工程菌GS115/pPIC9K‑lunasin；3)重组luansin多肽的发酵生产将上述获得的G418高抗性的阳性克隆重组工程菌株GS115/pPIC9K‑lunasin接种于BMGY培养基中，在30℃下培养直至OD₆₀₀为2.0‑4.0，离心收集细胞，然后将细胞重悬于BMMY培养基中培养直至OD₆₀₀为1.0‑2.0，0.5％甲醇诱导表达；经甲醇诱导重组lunasin多肽的发酵液高速离心除去细胞后，上清液使用Trish‑Tricine SDS‑PAGE蛋白电泳，以筛选得到高表达lunasin多肽的基因工程菌株；4)重组luansin多肽的分离纯化将上述筛选得到的高表达重组工程菌株再次发酵生产，得到的发酵液经高速离心除去菌体后，上清中加入CaCl₂溶液，充分混匀后室温静置5min，高速离心得到沉淀，该沉淀经真空冷冻干燥得重组lunasin多肽粗产物；将粗产物以浓度为10mg/mL溶解，使用DEAE阴离子交换柱，根据出峰时间分部分收集洗脱液，真空干燥后，经Trish‑Tricine SDS‑PAGE蛋白电泳，收集lunasin多肽富集洗脱液，合并后过超滤膜浓缩液。浓缩液经真空冷冻干燥后得到纯度为93％的重组lunasin多肽。