[发明专利]基于表达HBsAg和HBcAg的热失活全重组汉逊酵母细胞的乙肝治疗疫苗

摘要

基于表达HBsAg和HBcAg的热失活全重组汉逊酵母细胞的乙肝治疗疫苗，以重组汉逊酵母胞内表达的HBsAgVLP和和HBcAgVLP为抗原，重组汉逊酵母表达的HBsAg的氨基酸序列中共含有19个CTL表位。重组汉逊酵母表达的HBcAg的氨基酸序列中共含有19个CTL表位，以热失活全重组汉逊酵母细胞为佐剂。热失活全重组汉逊酵母细胞为最主要专职抗原递呈细胞(DC)Dectin‑1受体的高效激动剂。HBV特异性CTL细胞，靶向感染HBV的肝细胞释放IFN‑γ：第一步非肝细胞损伤地减少其90％以上cccDNA分子池，第二步提高了过程中损伤受HBV感染的肝细胞，并触发HBV免疫逆转。

主权项

1.基于表达HBsAg和HBcAg的全重组汉逊酵母细胞的乙肝治疗疫苗，所述乙肝治疗疫苗包括HBsAg和HBcAg，其特征在于：所述重组汉逊酵母表达的HBcAg的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述重组汉逊酵母表达HBcAg的DNA序列为SEQ ID NO：3所示，含有15‑21个HBcAg特异性CTL表位；所述重组汉逊酵母表达的HBsAg为adw亚型，所述重组汉逊酵母表达HBsAg的DNA序列如SEQ ID NO:1所示，重组汉逊酵母表达的HBsAg的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述重组汉逊酵母细胞内HBsAg表达量为每108细胞中含有6‑10μg HBsAg，所述HBsAg共含有16‑21个HBsAg特异性CTL表位；将热失活的所述全重组汉逊酵母细胞作为佐剂，所述重组汉逊酵母表达HBsAg的工程菌株为HS604‑5，所述的重组汉逊酵母表达HBcAg的工程菌株为HBC‑40‑25，所述重组汉逊酵母表达HBsAg的工程菌株构建方法包括：1)将构建的基于SEQ ID NO：1所示序列的质粒，电转化宿主细胞URA3‑营养缺陷型汉逊酵母细胞株HU‑11(CGMCC No.1218)，在MD选择培养系平皿上挑取生长的单菌落转化子；2)挑选菌体生长速度快的菌落，应用半定量PCR技术检测HBsAg基因条带亮度后，挑选拷贝数多的菌落，连续传代培养筛选20～400个世代；3)经过步骤2)传代培养筛选多拷贝异源整合转化克隆株，采用甲醇诱导培养72小时后，放免分析测定转化株细胞破碎后释放出HBsAg的表达水平；4)将经过步骤3)筛选去除游离质粒的高拷贝、高表达克隆株，采用定量PCR检测HBsAg基因拷贝数；5)在步骤4)的检测结果基础上，选择30升发酵遗传稳定的重组汉逊酵母HBsAg菌株作为工程菌的原代菌株HS604‑5；所述重组汉逊酵母表达HBcAg的工程菌株HBC‑40‑25构建方法与重组汉逊酵母表达HBsAg的工程菌株HS604‑5构建方法相同，构建工程菌株HBC‑40‑25采用的质粒为构建的基于SEQ ID NO：3所示序列的质粒。