[发明专利]一种培养戊型肝炎病毒的方法

摘要

本发明公开了一种戊型肝炎病毒在体外培养的方法；该方法通过对细胞转染miRNA-A6 24h后接种病毒，能够使病毒大量复制，利用Real-Time qPCR和Western Blot分析揭示了转染miRNA-A6可促进HEV子代病毒大量复制。该发明在HEV体外培养方面是一个大的突破，为进一步研究HEV的生物学特性及免疫学特性， 研发HEV疫苗及抗HEV药物的筛选奠定了良好的基础。

主权项

一种培养戊型肝炎病毒的方法，其特征在于按如下步骤进行：（1）将HEV病毒溶液经0.22μm滤膜过滤除菌后，加入病毒溶液体积1～2%的双抗溶液，4℃处理1h，‑80℃保存备用，经Real‑time qPCR测定其病毒拷贝数为2×10⁵～2×10⁶拷贝数/mL，其中双抗溶液为含有400U/mL青霉素和1000U/mL链霉素的溶液；（2）将A549细胞按2×10⁵/孔接种至6孔板中，用含质量百分比10%胎牛血清的DMEM培养基在37℃、5% CO₂培养箱中静止培养细胞，直至细胞汇合度70%~80%；1×PBS洗涤细胞3次，加入无血清的DMEM培养基，将miRNA‑A6脂质体转染混合物滴入孔板中，6h后采用1×PBS洗涤细胞3次，加入10% 胎牛血清的DMEM培养基，在37℃、5% CO₂培养箱中静止培养24h；（3）将步骤（1）的HEV病毒悬液按每孔500μL接种至步骤（2）的细胞中，置37℃孵育1小时，每15min 轻微摇匀一次，使病毒充分吸附到细胞上，同时添加0.01mM MgCl₂保护病毒颗粒的完整性及增强病毒与细胞的吸附作用；弃上清，1×PBS洗涤细胞3次，加入含质量百分比2%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5% CO₂培养箱中继续培养；（4）接种HEV病毒6~7天后A549细胞出现病变现象，反复冻融，收集病变细胞及培养液，‑80℃保存待用。