[发明专利]一种毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的培养方法

摘要

本发明涉及干细胞诱导培养领域，尤其涉及一种毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的培养方法。本发明所提供的毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的培养方法包括：(1)大鼠毛囊干细胞的分离；(2)大鼠毛囊干细胞的培养；(3)大鼠毛囊干细胞的纯化；(4)大鼠毛囊干细胞体外诱导分化为血管内皮细胞的培养。通过本发明所提供的培养方法得到了用于促进创伤后皮肤早期血管化的血管内皮细胞，从而有利于促进创伤皮肤的修复；同时，也可为组织工程化皮肤的血管化、细胞移植治疗缺血性疾病等难题提供种子细胞来源。

主权项

一种毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的培养方法，其特征在于，所述毛囊干细胞诱导分化为血管内皮细胞的培养方法包括以下步骤：(1) 大鼠毛囊干细胞的分离：取新生1周龄SD大鼠，大鼠的体重为24±4 g，颈椎脱臼法处死后，放入装有75%乙醇的烧杯消毒后取出；在超净台中，用眼科剪剪短触须并剪下触须部皮肤，75%乙醇再漂洗1次，之后用PBS漂洗3次，然后用1% Ⅳ 型胶原酶和1% Dispase酶混合液37℃ 消化90 min后，用PBS洗两次，体视显微镜下用注射器针头将毛囊脱鞘，切去两端，留下隆突部，将毛囊隆突部接种到铺预先包被的培养皿中，加入1 ml完全培养基；(2) 大鼠毛囊干细胞的培养：在37℃、5% CO₂培养条件下培养1 h，再缓缓加入2 ml完全培养基继续培养3 h，待组织基本贴壁后继续缓慢加入3 ml完全培养基，之后每2‑3 d换液；(3) 大鼠毛囊干细胞的纯化：培养8‑10d后用胰蛋白酶‑PBS稀释液漂洗3次，再用TrypLE™ Select(1X)胰蛋白酶替代酶37℃、5%CO₂培养箱中消化约8min，用Ⅳ型胶原差速贴壁法，使Ⅳ型胶原室温预包被1h，利用15‑20 min贴壁时间差，对此时间内贴壁的细胞继续用完全培养基培养，达到筛选纯化目的，之后每 2‑3天换液1次；第2代细胞再纯化1次；(4) 大鼠毛囊干细胞体外诱导分化为血管内皮细胞的培养：取纯化后的第3代大鼠毛囊干细胞，待贴壁细胞达到约60%融合，进行体外诱导，诱导时吸去完全培养基，加入诱导培养基，37℃、5%CO₂培养条件下培养，之后每2天换液1次。