[发明专利]一种禽流感灭活疫苗的灭活检验方法

摘要

本发明公开了一种禽流感灭活疫苗的灭活检验方法，包括以下步骤：将灭活后的禽流感液在MDCK细胞上吸附30-35min；吸附后，在细胞瓶中加入DMEM培养液，将细胞瓶置于35℃的CO₂培养箱中培养几天后，收获细胞培养液，并冻融3次；然后连续盲传3代，盲传3代的各瓶细胞均无细胞病变出现，则判定为禽流感抗原液灭活完全；各代细胞瓶任何1瓶出现细胞病变，则判定为禽流感抗原液灭活不完全。本发明采用MDCK传代细胞系进行禽流感灭活抗原的灭活检验，因传代细胞的稳定和均一，并且因采用无外源微生物污染的MDCK细胞，从而保证了检验结果的准确性。

主权项

一种禽流感灭活疫苗的灭活检验方法，其特征在于：其包括以下步骤：1) 取至少3瓶细胞瓶培养 MDCK细胞24‑30h，MDCK细胞生长密度达 80%以上时，弃去生长液，用0.01mol/L的pH7.2的磷酸盐缓冲液洗涤细胞瓶3‑4次；2) 向各细胞瓶中分别加入1ml含胰酶的DMEM培养液，室温放置15‑20min，所述DMEM培养液中胰酶的质量浓度为25‑50μg /ml；3) 将灭活后的禽流感抗原液做10倍稀释后，各取1‑1.5mL分别接种于各个细胞瓶中，将细胞瓶置于 35℃的CO₂培养箱中孵育30‑35min，使灭活后的禽流感抗原液在MDCK细胞上吸附，期间振摇1‑2次，所述CO₂培养箱中CO₂的浓度为5%；4) 吸附后，在各细胞瓶中分别加入8‑10ml DMEM培养液，将细胞瓶继续置于上述CO₂培养箱中继续培养5天后，收获细胞培养液，并反复冻融3次，此为盲传第1代；5) 取至少3瓶已生长24‑30h，并且生长密度达80%以上的MDCK细胞，弃去生长液，用0.01mol/L的pH7.2的磷酸盐缓冲液洗涤细胞瓶3‑4次；6）向各细胞瓶中分别加入1ml含胰酶的DMEM培养液，室温放置15‑20min，所述DMEM培养液中胰酶的质量浓度为25‑50μg /ml；7）取上述步骤4）冻融后的细胞培养液1‑1.5mL，接种于各细胞瓶中，将细胞瓶置于 35℃的CO₂培养箱中孵育30‑35min，期间振摇1‑2次，所述CO₂培养箱中CO₂的浓度为5%；8）在各细胞瓶中分别加入8‑10mlDMEM培养液，将细胞瓶继续置于上述CO₂培养箱中继续培养5天后，收获细胞培养液，并反复冻融3次，此为盲传第2代；9）重复上述步骤5）‑步骤8），此为盲传第3代；10）灭活检验方法：结果判定：上述步骤中盲传3代的各瓶细胞均无细胞病变出现，则判定为禽流感抗原液灭活完全；各代细胞瓶任何1瓶出现细胞病变，则判定为禽流感抗原液灭活不完全。