[发明专利]一种高纯度白喉类毒素原液的制备方法

摘要

本发明公开了一种高纯度白喉类毒素原液的制备方法，该方法包括活菌培养(1)、甲醛灭活(2)、菌液分离(3)、除菌过滤(4)、超滤浓缩(5)、超滤透析(6)、离子交换脱色(7)、盐析(8)、脱盐(9)、甲醛脱毒(10)和除菌过滤(11)十一道工艺步骤。本发明采用上述制备工艺，在制备过程中用离子交换器对制品进行脱色的技术方案，克服了现有技术存在制备周期长、效率低、一致性差、纯度难以提高的问题与不足，使白喉类毒素原液的制备，达到了缩短制备周期、提高效率、提高品质的一致性、提高纯度的目的。

主权项

一种高纯度白喉类毒素原液的制备方法，包括活菌培养(1)、甲醛灭活(2)、菌液分离(3)、除菌过滤(4)、超滤浓缩(5)、超滤透析(6)、离子交换脱色(7)、盐析(8)、脱盐(9)、甲醛脱毒(10)和除菌过滤(11)工艺步骤，其特征在于：所述的活菌培养(1)为步骤一，采用白喉杆菌CMCC38007冻干菌种，经过两代改良马丁培养基复苏，再接种于改良林氏培养基进行菌种扩增，获得增殖菌，之后，将所述增殖菌移至发酵罐内进行搅拌通气培养，搅拌转速500转/分钟，温度33～36℃，用时40～50小时，获得活菌浆；所述的甲醛灭活(2)为步骤二，按所述活菌浆体积的0.6％的体积比，向发酵罐内加入质量浓度为40％的甲醛溶液进行搅拌灭活杀菌，搅拌转速100转/分钟，用时1小时，获得灭活浆；所述的菌液分离(3)为步骤三，用E连续流离心机对所述灭活浆进行离心菌液分离，去除大部分菌体获取含毒素的培养液；具体为，开启E连续流离心机，待速度达到10000转/分钟，稳定(2)分钟，将所述灭活浆通过蠕动泵泵入E连续流离心机进行离心菌液分离，蠕动泵流速1.5～2升/分钟，收集流出液获得浆液；所述的除菌过滤(4)为步骤四，用设有0.22μm滤芯的A除菌滤器去除所述浆液中的剩余菌体获得澄清的除菌浆；具体为，将所述浆液通过蠕动泵泵入A除菌滤器，蠕动泵流速1.5升/分钟，收集流出液获得除菌浆；所述的超滤浓缩(5)为步骤五，用C超滤器对所述除菌浆进行大小分子溶液分离，去除小分子溶液获取大分子溶液；具体为，将所述除菌浆移至C超滤器内，C超滤器使用30千道尔顿的改良聚醚砜质的膜包，简称30kD膜包，所述30kD膜包的进口的泵压压力为0.1MPa，C超滤器回流口的压力为0.5MPa，开机，对所述除菌浆进行大小分子溶液分离浓缩，其中小分子溶液经C超滤器的出口排出，大分子溶液经C超滤器的回流口返回C超滤器内与尚未分离的所述除菌浆混合，再次参与循环分离浓缩；当C超滤器内的除菌浆浓缩至原体积的1/10～1/15时，停机，停止浓缩，此时存留在C超滤器内的溶液为大分子溶液；所述的超滤透析(6)为步骤六，在C超滤器中对所述大分子溶液进行超滤透析洗滤，获得超滤浓缩液；具体为，将磷酸盐缓冲液注入C超滤器内与所述大分子溶液混合，开机，通过所述膜包对所述大分子溶液进行等体积透析洗滤，待洗滤至电导5～10毫西门子/厘米，pH7.4时，停止注入磷酸盐缓冲液，关机，停止透析洗滤，获得超滤浓缩液；所述等体积透析洗滤为注入多少磷酸盐缓冲液，C超滤器的出口排出多少洗滤废液，始终保持C超滤器内所述大分子溶液的原体积；所述的离子交换脱色(7)为步骤七，用离子交换器对所述超滤浓缩液进行透析脱色，获得脱色液；具体为，用蠕动泵将所述超滤浓缩液泵过离子交换器，通过离子交换膜对所述超滤浓缩液进行脱色；蠕动泵流速为500毫升/分钟；获得脱色液；所述的盐析(8)为步骤八，用台式离心机，用硫酸铵对所述脱色液进行盐析获得盐析物；具体为，将所述脱色液移至反应釜中，按25％的质量比在所述脱色液中缓慢加入硫酸铵，并搅拌混合，搅拌转速100～200转/分钟，搅拌用时30分钟，获得溶盐液；之后，将所述溶盐液置于F台式离心机内进行离心去沉淀，F台式离心机转速7000转/分钟，离心用时15分钟，去除所述溶盐液的大分子沉淀杂质，收集上层的清液得到清盐液；之后将所述清盐液移至反应釜中，按20％的质量比在所述清盐液中缓慢加入硫酸铵，并搅拌混合，搅拌转速100～150转/分钟，搅拌用时30分钟，获得盐析液；之后，将所述盐析液置于G台式离心机内进行离心去液，G台式离心机转速7000转/分钟，离心用时15分钟，去除所述盐析液上层的清液，收集下层的沉淀，获得盐析物；所述的脱盐(9)为步骤九，用D超滤器，用注射用水，对所述盐析物进行稀释并超滤脱盐，获得絮状单位800‑1500Lf/ml的毒素物；具体为，按按100∶1的体积比，用注射用水溶解稀释所述盐析物中的硫酸铵，获得浴水盐析物；之后，将所述浴水盐析物移至设有30kD膜包的D超滤器中，开机进行超滤脱盐，并同时向D超滤器中补入注射用水，待D超滤器的出口排出的废液中的硫酸铵含量小于0.01％时，停止补入注射用水，待D超滤器的出口无废液排出后，关机停止超滤脱盐，获得絮状单位800‑1500Lf/ml的毒素物；所述的甲醛脱毒(10)为步骤十，用甲醛对所述毒素物进行脱毒，获得脱毒物；具体为，将所述毒素物置于玻璃容器中，按所述毒素物体积比的0.5％加入质量浓度为40％的甲醛溶液，再按毒素物体积比的2％加入质量浓度为9.125％的赖氨酸溶液，搅拌调pH至7.2‑7.8，静置脱毒，静置温度38～40℃，静置用时42天，获得脱毒物；所述的除菌过滤(11)为步骤十一，用B除菌滤器进行除菌过滤，获得原液；具体为，将所述脱毒物置于玻璃容器中，按所述脱毒物质量比的0.85％加入氯化钠，搅拌调pH至6.6‑7.4，之后，用设有0.22μm滤芯的B除菌滤器进行除菌过滤，获得白喉类毒素原液。