[发明专利]一种乳腺癌肿瘤标志物免疫传感器的制备方法及应用

摘要

本发明属于免疫分析和生物传感技术领域，提供了一种乳腺癌肿瘤标志物免疫传感器的制备方法及应用；采用银纳米粒子@对苯硫酚功能化磺化碳纳米管标记的电化学免疫传感器，实现了常见乳腺癌肿瘤标志物的检测，具有特异性强，灵敏度高，检测限低，对乳腺癌的检测具有重要的科学意义和应用价值。

主权项

一种乳腺癌肿瘤标志物免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将直径为3 ~ 5mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；（2）取6µL、0.5 ~ 2.0mg/mL的负载金纳米粒子石墨烯滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；（3）继续将6 µL、5 ~ 15 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1滴加到电极表面，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中干燥；（4）继续将3 µL、1~ 2 mg/mL的BSA溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；滴加6 µL、0.001 ~ 30 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原Ag溶液，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中干燥；（5）将6 µL、1~ 3 mg/mL的银纳米粒子@对苯硫酚功能化磺化碳纳米管检测抗体Ab2孵化物溶液，滴涂于电极表面，置于4℃冰箱中晾干，制得一种乳腺癌肿瘤标志物免疫传感器；其中负载金纳米粒子石墨烯的制备步骤如下：①氨基化石墨烯的制备取40 ~ 60mg氧化石墨烯溶解在10mL的无水甲苯中，加入0.2mL 3‑氨丙基三乙氧基硅烷，油浴加热至60 ~70˚C，磁力搅拌1.5h，后在110˚C下烘干得到氨基化石墨烯；②金纳米粒子溶液的制备将1~ 2mL、质量分数为1%的 HAuCl4加入到99mL超纯水中，加热至沸腾加入1.5~3.5mL、质量分数为1%的柠檬酸钠溶液，回流15 ~ 30min，后冷却至室温，得到酒红色的金纳米粒子溶液；③负载金纳米粒子的石墨烯的制备取20~ 30mg氨基化石墨烯加入到上述步骤②制得的金纳米粒子溶液中，振荡12h，制得负载金纳米粒子石墨烯；银纳米粒子@对苯硫酚功能化磺化碳纳米管检测抗体Ab2孵化物溶液的制备步骤如下：①磺化碳纳米管的制备称取0.5 ~ 1.5g的多壁碳纳米管置于250mL三口烧瓶中，依次加入66mL浓硫酸和22mL浓硝酸，120˚C油浴下反应30~ 50min，冷却至室温后，将所得悬浊液移入500mL烧杯，加300mL超纯水稀释，抽滤，用超纯水洗涤至滤液成中性，所得固体于75~ 85˚C真空干燥箱内干燥10~ 14h，得到磺化碳纳米管；②对苯硫酚功能化磺化碳纳米管的制备在250mL圆底烧瓶中依次加入9~15mg磺化碳纳米管，50mL、1mol/L的盐酸溶液，超声分散1h，加入1.0g 4,4’‑二氨基二苯二硫醚，冰浴冷却至0˚C，在搅拌下缓慢加入10mL亚硝酸钠水溶液，反应1h，升温至40˚C，继续搅拌下反应1.5~2.5 h，用0.45μm的聚四氟乙烯膜抽滤，超纯水洗涤3次，无水乙醇洗涤3次，得到的固体超声分散到50mL乙醇中，依次加入50mL乙腈和520mg三苯基磷，搅拌1h，用0.45μm的聚四氟乙烯膜抽滤，用无水乙醇洗涤5次，所得固体80˚C真空干燥箱内干燥12h，得到对苯硫酚功能化磺化碳纳米管；所述的亚硝酸钠水溶液是将280mg固体亚硝酸钠溶于10mL超纯水制得；③银纳米粒子溶液的制备将1mL、50mmol/L的硝酸银和1mL、5％的柠檬酸钠，在搅拌下加入到48mL超纯水中，然后加入45~ 55mg硼氢化钠，在搅拌下反应10min，溶液变为棕黄色，持续搅拌，至溶液颜色不再变化，冷却至室温，在转速5000rpm下离心5min，所得的上清液为银纳米粒子溶液；④银纳米粒子@对苯硫酚功能化磺化碳纳米管检测抗体Ab2孵化物溶液的制备取5~10 mg对苯硫酚功能化磺化碳纳米管加入到20~40mL银纳米粒子溶液中， 130rpm转速下振荡10 ~14h，离心，80˚C真空干燥箱内干燥，制得银纳米粒子@对苯硫酚功能化磺化碳纳米管；将2~6 mg的银纳米粒子@对苯硫酚功能化磺化碳纳米管分散到1mL超纯水中，加入100μL、80~120μg/mL的肿瘤标志物检测抗体Ab2溶液和900 μL、50mmol/L的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液，4 ˚C恒温振荡培养箱中振荡孵化12 h；在4 ˚C下，6000 rpm转速下离心15 min，得到下层沉淀，加入1mL、50mmol/L 的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次，得下层沉淀，最后加入1mL、50mmol/L 的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液，制得银纳米粒子@对苯硫酚功能化磺化碳纳米管检测抗体Ab2孵化物溶液，4 ˚C下保存备用。