[发明专利]草木樨属18个物种植物条形码的目标条形码基因及其制备方法

摘要

本发明涉及一种鉴定草木樨属18个物种植物DNA条形码技术及其应用方法。挑选整合ITS、psbA‑trnH、rbcL、matK、trnL这5个基因作为鉴定草木樨18个种的目标DNA条形码基因。基于ContigExpress的数据组织、编辑和分析法及ClustalW的多序列比对法，基于最小进化原理的Neighbor‑Joining算法和no of difference方法构建聚类图，形成一种鉴定草木樨属18个物种植物DNA条形码技术的基本用法，确立标准分类条形码基因及对应序列。该技术建立了一种快捷、高效、准确率高的草木樨属不同物种DNA条形码鉴定方法，对草木樨属各物种的区分及种质资源的利用具有重要意义。

主权项

一种草木樨属18个植物条形码的目标条形码基因的制备方法，其特征在于包括有以下步骤：A.通过草木樨的不同生物学特性初步鉴定18个种；B.幼苗DNA的提取；C.目标 DNA 条形码基因的筛选：通过预实验筛选最终确定 ITS、psbA‑trnH、rbcL、 matK、trnL 为目标条形码基因；D.目标DNA条形码基因片段的扩增与测序；通过预实验确定 5 个目标基因的反应体系和扩增条件；总反应体系为 25 µl：2×Reaction Mix 12.25 µl, Golden DNA Polymerase 0.25 µl,正反向引物各 2.5 µl, ddH2O 5 µl,2)中 DNA 模板 2.5 µl；基于 ITS 基因的特异引物对为，正向基因(5′‑3′)：GGAAGKARAAGTCGTAACAAGG； 反向基因(5′‑3′)：RGTTTCTTTTCCTCCGCTTA；基于 psbA‑trnH 基因的特异引物对为，正向基因(5′‑3′)：GTTATGCATGAACGTAATGCTC； 反向基因(5′‑3′)：CGCGCATGGTGGATTCACAAATC； 基于 rbcL 基因的特异引物对为，正向基因(5′‑3′)；AGACCTWTTTGAAGAAGGTTCWGT； 反向基因(5′‑3′)：TCGGTYAGAGCRGGCATRTGCCA；基 于 matK 基因的特异引物对为，正向基因 (5 ′ ‑3 ′ ) ； CCCRTYCATCTGGAAATCTTGGTTC ；反向基因 (5 ′ ‑3 ′ ) ： GCTRTRATAATGAGAAAGATTCTGC；基于 trnL 基因的特异引物对为，正向基因(5′‑3′)；CGAAATCGGTAGACGCTACG； 反向基因(5′‑3′)：ATTTGAACTGGTGACACGAG；使用上述特异引物对对草木樨属18个物种植物基因片段进行扩增与测序；E.测序结果的核查；F.序列比对、编辑、质量核查、目标DNA条形码序列建树；G.标准分类DNA条形码基因及对应序列的确认；H.标准分类DNA条形码基因及对应序列准确性验证；所述的步骤F，包括基于ContigExpress的数据组织、编辑和分析法及ClustalW的多序列比对法，基于MEGA软件最小进化原理的Neighbor‑Joining算法和no of difference方法构建聚类图；所述的步骤G中所述的草木樨属18个物种植物标准分类DNA条形码基因对应序列是以下序列1到序列18所示的DNA片段：序列1的名称为：M.wolgicus_A1_matK，序列为：ttcatttatt acgattgttt ctttataatt tttgtaattg gaatagtttt attactaccaaaaaatcgat ttctactttt tcaaaaagta atccgagatt attcttgttc ctctataatttttatgtatg tgaatatgaa tctatcttcc tttttctacg taataaatcc tctcatttacgattaaaatc ttttagcgtt ttttttgaac gaattttttt ttatgcaaaa agagaacatcttgtagaagt ttttgctaag gatttttcgt atactttaac atttttcaag gatcctctcattcattatgt tagatatcaa ggaaaatgca ttctggcttc aaagaatgcg ccttttttgatgaataaatg gaaacactat tttatccatt tatggcaagg tttttttgat gtttggtctcaaccaagaac gatcaatata aaccgattat ccgaacattc atttcagctt ttaggctattttttaaatgt gcggctaaat cgttcagtgg tacggagtca aatgctgcaa aatacatttctaatcgaaat tgttagcaaa aaacttgata taatagttcc aattattcct ctaattagatccttggctaa agctaaattt tgtaatgtat taggacatcc tattagtaag ccggtctgggccgattcatc cgattttgat attattgacc gatttttgcg aatatgcaga atct序列2的名称为：M.tauricus_A36_matK，序列为：ttcatttatt acgattgttt ctttataatt tttgtaattg gaatagtttt attactaccaaaaaatcgat ttctactttt tcaaaaagta atccgagatt attcttgttc ctctataatttttatgtatg tgaatatgaa tctatcttcc tttttctacg taataaatcc tctcatttacgattaaaatc ttttagcgtt ttttttgaac gaattttttt ttatgcaaaa agagaacatcttgtagaagt ttttgctaag gatttttcgt atactttaac atttttcaag gatcctctcattcattatgt tagatatcaa ggaaaatgca ttctggcttc aaagaatgcg ccttttttgatgaataaatg gaaacactat tttatccatt tatggcaagg tttttttgat gtttggtctcaaccaagaac gatcaatata aaccaattat ccgaacattc atttcagctt ttaggctattttttaaatgt gcggctaaat cgttcagtgg tacggagtca aatgctgcaa aatacatttctaatcgaaat tgttagcaaa aaacttgata taatagttcc aattattcct ctaattagatccttggctaa agctaaattt tgtaatctat taggacatcc tattagtaag ccggtctgggccgattcatc cgattttgat attattgacc gatttttgcg aatatgcaga atct序列3的名称为：M.albus_A9_matK，序列为：ttcatttatt acgattgttt ctttatcatt tttgtaattg gaatagtttt attactaccaaaaaatcgat ttctactttt tcaaaaagta atccgagatt attcttgttc ctctataatttttatgtatg tgaatatgaa tctatcttcc tttttctacg taataaatcc tctcatttacgattaaaatc ttttagcgtt ttttttgaac gaattttttt ttatgcaaaa agagaacatcttgtagaagt ttttgctaag gatttttcgt atactttaac atttttcaag gatcctctcattcattatgt tagatatcaa ggaaaatgca ttctggcttc aaagaatgcg ccttttttgatgaataaatg gaaacactat tttatccatt tatggcaagg tttttttgat gtttggtctcaaccaagaac gatcaatata aaccaattat ccgaacattc atttcagctt ttaggctattttttaaatgt gcggctaaat cgttcagtgg tacggagtca aatgctgcaa aatacatttctaatcgaaat tgttagcaaa aaacttgata taatagttcc aattattcct ctaattagatccttggctaa agctaaattt tgtaatgtat taggacatcc tattagtaag ccggtctgggccgattcatc cgattttgat attattgacc gatttttgcg aatatgcaga atct序列4的名称为：M.officinalis_A48_matK，序列为：ttcatttatt acgattgttt ctttataatt tttgtaattg gaatagtttt attactaccaaaaaatcgat ttctactttt tcaaaaagta atccgagatt attcttgttc ctctataatttttatgtatg tgaatatgaa tctatcttcc tttttctacg taataaatcc tctcatttacgattaaaatc ttttagcgtt ttttttgaac gaattttttt ttatgcaaaa agagaacatcttgtaaaagt ttttgctaag gatttttcgt atactttaac atttttcaag gatcctctcattcattatgt tagatatcaa ggaaaatgca ttctggcttc aaagaatgcg ccttttttgatgaataaatg gaaacactat tttatccatt tatggcaagg tttttttgat gtttggtctcaaccaagaac gatcaatata aaccaattat ccgaacattc atttcagctt ttaggctattttttaaatgt gcggctaaat cgttcagtgg tacggagtca aatgctgcaa aatacatttctaatcgaaat tgttagcaaa aaacttgata taatagttcc aattattcct ctaattagatccttggctaa agctaaattt tgtaatgtat taggacatcc tattagtaag ccggtctgggccgattcatc cgattttgat attattgacc gatttttgcg aatatgcaaa atctttc序列5的名称为：M.dentatus_A3_matK，序列为：ttcatttatt acgattgttt ctttataatt tttgtaattg gaatagtttt attactaccaaaaaatcgat ttctactttt tcaaaaagta atccgagatt attcttgttc ctctataatttttatgtatg tgaatatgaa tctatcttcc tttttctacg taataaatcc tctcatttacgattaaaatc ttttagcgtt ttttttgaac gaattttttt ttatgcaaaa agagaacatcttgtagaagt ttttgctaag gatttttcct atactttaac atttttcaag gatcctctcattcattatgt tagatatcaa ggaaaatgca ttctggcttc aaagaatgcg ccttttttgatgaataaatg gaaacactat tttatccatt tatggcaagg tttttttgat gtttggtctcaaccaagaac gatcaatata aaccaattat ccgagcattc atttcagttt ttaggctattttttaaatgt gcggctaaat cgttcagtgg tacggagtca aatgctgcaa aatacatttctaatcgaaat tgttagcaaa aaacttgata taatagttcc aattattcct ctaattagatccttggctaa agctaaattt tgtaatgtat taggacatcc tattagtaag ccggtctgggccgattcatc cgattttgat attattgacc gatttttgcg aatatgcaga atct序列6的名称为：M.hirsutus_A8_psbA‑trnH，序列为：ctgcggtcga ggctccatct ataaatggat aatattttgg ttttaaagaa ggatacgagtttttgaaagt aaagggggga gtaatatcaa cattgttgat attactcctt tacccctttactttttgtta gtatgtatac atatacagaa atgaatgttt tcttattttc tagtattttagaagactcgt aagaacttag aagagaagaa aataaatgat aatcaaaagg tataaaaagttatgtaattt agacatagta tagggcggat gtagccaagt ggatcaaggc agtggatttgtgaatccacc atgcgcga序列7的名称为：M.sulcatus_A20_ psbA‑trnH，序列为：ctgcggtcga agctccatct ataaatggat aatattttgg ttttaaagaa ggatacgagtttttgaaagg aaagggggga gtaatatcaa caatgttgat attacttctt tacccctttcctttttgtta gtatgtatac atatacagaa atgaatgttt tcttattttc tagtagtttagaagactcgt aagaacttag aagagaagaa aataaatgat aatcaaaagg tataaaaagttatgtaattt agacatagta tagggcggat gtagccaagt ggatcaaggc agtggatttgtgaatccacc atgcgcga序列8的名称为：M.speciosus_A29_psbA‑trnH，序列为：ctgcggtcga gctccatcta taaatggata atattttggt tttaaagaag gatacgagtttttgaaagga aaggggggag taatatcaac aatgttgata ttactccttt cctttttgttagtatgtata catatacaga aatgaatgtt ttcttatttt atagtatttt agaagactcgtaagaactta gaagaaaata aatgataatc aaaaggtata aaaagttatg taatttagacatagtatagg gcggatgtag ccaagtggat caaggcagtg gatttgtgaa tccaccatgcgcga序列9的名称为：M.elegans_A31_psbA‑trnH，序列为：ctgcggtcga ggctccatct ataaatggat aatattttgg ttttaaagaa ggatacgagtttttgaaagt aaagggggga gtaatatcaa cattgttgat attactcctt tacccccttactttttgtta gtatgtatac atatacagaa atgaatgttt tcttattttc tagtattttagaagactcgt aagaacttag aagagaagaa aataaatgat aatcaaaagg tataaaaagttatgtaattt agacatagta tagggcggat gtagccaagt ggatcaaggc agtggatttgtgaatccacc atgcgcga序列10的名称为：M.segetalis_A19_psbA‑trnH，序列为：ctgcggtcga ggctccatct ataaatggat aatattttgg ttttaaagaa ggatacgagtttttgaaagt aaaggggtaa aggagtaata tcaacattgt tgatattact cctttactttttgttagtat gtatacatat acagaaatga atgttttctt tttttctagt attttagaagactcgtaaga acttagaaga gaagaaaata aatgataatc aaaaggtata aaataaaaagttatgtaatt tagacatagt atagggcgga tgtagccaag tggatcaagg cagtggatttgtgaatccac catgcgcga序列11的名称为：M.infestus_A6_rbcL，序列为：cgcgctctac gtctggaaga tttgcgaatc ccagttgctt atgttaaaac tttccaaggtcctcctcacg gaatccaagt tgagagagat aaattgaaca agtatggacg tcccctattgggatgtacta ttaaacctaa gttgggttta tccgctaaga attacggtag agcagtttatgaatgtctac gcggtggact tgattttacc aaagatgatg aaaatgtgaa ctcccaaccatttatgcgtt ggagagaccg tttcttattt tgtgccgaag ctatttataa atcacaggccgaaacaggtg aaatcaaagg acattatttg aatgctactg cgggtacatg tgaagaaatgataaaaagag cagtatttgc tagagaatta ggcgtgccta tcgtaatgca tgactacttaaccgggggat tcactgcaaa tacttccttg gctcactatt gccgcgataa tggtctacttcttcacatcc accgtgcaat gcatgcagtt atcgatagac agaaaaatca tggtatccactttcgtgtat tagctaaagc gttacgtatg tctggtggtg atcatattca ctctggtactgtagtaggta aacttgaagg agaaagggat attactttag gttttgttga tttactacgtgatgatttta ttgaaaaaga tagaagtcgc ggtatttatt tcactcagga ttgggtttctttaccaggtg ttctgcctgt tgcttcgggt ggta序列12的名称为：M.indicus_A4_rbcL，序列为：cgcgctctac gtctggaaga tttgcgaatc ccagttgctt atgttaaaac tttccaaggtcctcctcacg gaatccaagt tgagagagat aaattgaaca agtatggacg tcccctattgggatgtacta ttaaacctaa attgggttta tccgctaaga attacggtag agcagtttatgaatgtctac gcggtggact tgattttacc aaagatgatg aaaatgtgaa ctcccaaccatttatgcgtt ggagagaccg tttcttattt tgtgccgaag ctatttataa atcacaggccgaaacaggtg aaatcaaagg acattatttg aatgctactg cgggtacatg tgaagaaatgataaaaagag ctgtatttgc tagagaatta ggcgtgccta tcgtaatgca tgactacttaaccgggggat tcactgcaaa tacttccttg gctcactatt gccgcgataa tggtctacttcttcatatcc accgtgcaat gcatgcagtt atcgatagac agaaaaatca tggtatccactttcgtgtat tagctaaagc gttacgtatg tctggtggtg atcatattca ctctggtactgtagtaggta aacttgaagg agaaagggag attactttag gttttgttga tttactacgtgatgatttta ttgaaaaaga tagaagtcgc ggtatttatt tcactcagga ttgggtttctttaccaggtg ttctgcctgt tgcttcgggc ggta序列13的名称为：M.italicus_A27_rbcL，序列为：cgcgctctac gtctggaaga tttgcgaatc ccagttgctt atgttaaaac tttccaaggtcctcctcacg gaatccaagt tgagagagat aaattgaaca agtatggacg tcccctattgggatgtacta ttaaacctaa attgggttta tccgctaaga attacggtag agcagtttatgaatgtctac gcggtggact tgattttacc aaagatgatg aaaatgtgaa ctcccaaccatttatgcgtt ggagagaccg tttcttattt tgtgccgaag ctatttataa atcacaggctgaaacaggtg aaatcaaagg acattatttg aatgctactg cgggtacatg tgaagaaatgataaaaagag ctgtatttgc tagagaatta ggcgtgccta tcgtaatgca tgactacttaaccgggggat tcactgcaaa tacttccttg gctcactatt gccgcgataa tggtctacttcttcatatcc accgtgcaat gcatgcagtt atcgatagac agaaaaatca tggtatacactttcgtgtat tagctaaagc gttacgtatg tctggtggtg atcatattca ctctggtactgtagtaggta aacttgaagg agaaagggag attactttag gttttgttga tttactacgtgatgatttta ttgaaaaaga tagaagtcgc gggatttatt tcactcagga ttgggtttctttaccaggtg ttctgcctgt tgcttcgggt ggta序列14的名称为：M.polonicus_A11_trnL，序列为：cttaccaagt gaaaactttc aaattcagag aaaccctgga attaaaaatg ggcaatcctgagccaaatcc ttctttccga aaacaaaaaa ataaaagttc agaaagttaa aatcaaaaaaggataggtgc agagactcaa tggaagctgt tctaacaacg agaataaaga tagagtcccattctacatgt caataccgac atcaatgaaa tttttagtaa gaggaaaatc cgtcgactttagaaatcgtg agggttcaag tccctctatc cccaaaagcc catttaactc tctaattttttatcctatat cccttttttt aattttaatt aaaaaaagta tttttttttt ttgaatttagttgacataga ctcaagtaat ttcttaaaat taaaatggtg cg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