[发明专利]一种高效快速抑制结缕草内源基因表达的方法

摘要

本发明公开了一种高效快速抑制结缕草内源基因表达的方法。结缕草的遗传转化极为困难，严重制约了其基因功能研究和分子育种工作的开展。本发明公开的新方法利用农杆菌介导的水稻东格鲁杆状病毒基因沉默载体特异性地下调结缕草内源基因的表达，为研究结缕草的基因功能提供了高效快捷的技术手段。所述方法包括以下步骤：1）结缕草目的基因片段的克隆；2）病毒诱导基因沉默载体的构建；3）农杆菌浸染结缕草植株；4）基因表达丰度的分子检测。使用本方法可以成功使结缕草内源基因的表达降低30%以上。

主权项

1.一种高效快速抑制结缕草内源基因表达的方法，其特征在于，所述的结缕草内源基因的cDNA全长序列如序列表的序列2所示，编码区为序列表中序列2自5’末端第147-1838位核苷酸；/n所述的方法包括以下步骤：/n(1)结缕草目的基因片段的克隆：提取结缕草RNA，逆转录成cDNA，通过PCR扩增获得目的基因长度为420bp的片段，上下游引物5’端分别加上限制性内切酶MluI和PacI的识别碱基序列ACGCGT和TTAATTAA，测序确认PCR扩增结果正确性；所述克隆扩增的目的基因片段是结缕草基因编码区456-875核苷酸区段；/n(2)病毒诱导基因沉默载体的构建：将结缕草目的基因片段和水稻东格鲁杆状病毒基因沉默载体进行酶切、连接、转化大肠杆菌，获得连入结缕草目的基因片段的病毒诱导基因沉默载体，挑取克隆、提取质粒、酶切验证克隆正确性；/n(3)农杆菌浸染结缕草植株：将连入结缕草目的基因片段的病毒诱导基因沉默载体转化农杆菌，将其扩大培养，使用浸染缓冲液重悬后真空辅助浸染光照16小时/黑暗8小时、28℃条件下培养7天的结缕草植株；/n(4)基因表达丰度的分子检测：提取对照结缕草植株和农杆菌浸染植株RNA，逆转录成cDNA，使用定量PCR检测目的基因的表达丰度变化。/n