[发明专利]运用CRISPR-Cas9系统敲除水稻MIRNA393b茎环序列的基因编辑方法

摘要

本发明涉及水稻转基因材料的构建，旨在提供一种运用CRISPR-Cas9系统敲除水稻MIRNA393b茎环序列的基因编辑方法。包括：选择gRNA靶位点进行克隆和GG连接，扩增后酶切，再与pGREB32载体连接；然后转化大肠杆菌感受态细胞；将测序结果正确的质粒转化农杆菌，并介导转化水稻愈伤组织获得转基因植株，获得转基因阳性株系；收取T0代突变体植株种子，发苗，对T1代植株进行纯合体筛选；经miR393b表达检测为阴性的纯合株系，即为完全丧失miR393b茎环序列及其表达的水稻突变体。本发明能有效敲除小RNA的茎环序列，且可以制备同一小RNA家族不同成员的功能丧失突变体。该突变体植株进行扩繁大量种子，是成功获得研究水稻MIRNA393b基因功能的理想材料。

主权项

运用CRISPR‑Cas9系统敲除水稻MIRNA393b茎环序列的基因编辑方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)gRNA靶位点的选择由于MIR393b基因位于水稻基因组的第四号染色体上，根据CRISPR‑Cas9技术的设计靶位点的原则，把第一个靶位点设计在MIR393b基因的前体茎环序列上，第二个靶位点在茎环序列下游3’端；(2)gRNA的片段克隆以质粒pGTR为模板，用PCR方法克隆三个片段L1、L2、L3部分重叠的片段，引物序列如下，其中F和R分别代表正、反向引物：L1F：cgggtctcaggcaggatgggcagtctgggcaacaaagcaccagtggL1R：cgggtctcagcgttgggcttctgcaccagccgggL2F：taggtctccacgctagcacacgttttagagctaggaaL2R：cgggtctcattcctcaggccgtgcaccagccgggL3F：taggtctccggaaactagtgggttttagagctagaaL3R：taggtctccaaacggatgagcgacagcaaacaaaaaaaaaagcaccgactcgPCR体系为：Phusion酶0.5μl；5×Buffer 10μl；引物各2.5μl；水30μl；dNTP 4μl；pGTR plasmid 0.5μl；PCR反应条件为：预变性95℃,5min；变性95℃，30s，；退火60℃,30s；延伸72℃,30s；共33个循环；最后延伸10min；PCR反应后，取5‑10μl产物，用2％的琼脂糖凝电泳检测后，纯化回收目的片段，测定三个PCR产物L1、L2、L3的浓度；(3)进行GG(gRNA‑gRNA)连接根据测定的PCR浓度，将三个片段等量混合，T7酶连接反应与BsaI酶切同时进行；取L1、L2、L3各2μl，与10μl T7 ligase buffer、1μlBsaI–HF、0.5μl T7 ligase、2.5μl水混合；在PCR仪中进行如下反应：37℃,5min；20℃,10min；30‑50个循环；(4)连接产物进行PCR扩增；连接反应结束后，取连接产物1μl，加19μl水稀释，将稀释后的产物作为模板，以L1F、L3R为引物做PCR扩增；PCR结束后，取5μl产物进行电泳检测，并将产物纯化；产物大小为350bp；(5)将上一步纯化的产物，FokI酶切暴露黏性末端，同时FokI酶切空载体pGREB32；酶切体系为20μl，包括底物5μl、FokI5μl、Buffer 10μl；底物包括GG纯化产物和空载体pGREB32；酶切时间3‑4h，酶切温度37℃；用1％琼脂糖凝胶检测酶切产物，并回收目标产物，测定浓度；(6)取酶切处理的GG产物与pGREB32载体等量混合，进行连接，连接酶为T4连接酶，4℃连接过夜；(7)将连接后的载体转化大肠杆菌感受态细胞，涂板过夜；挑取单菌落，摇菌4‑6h，提取质粒，取样品进行测序；将测序结果正确的质粒，转化农杆菌EHA105；(8)农杆菌介导转化水稻愈伤组织获得转基因植株以野生型水稻日本晴为材料诱导愈伤组织，进行农杆菌介导的水稻转化实验；以EHA105农杆菌进行感染转化，经潮霉素抗性筛选，抗性愈伤组织分化再生获得转基因阳性株系；(9)获得阳性株系后，提取基因组DNA，在两个gRNA序列的两侧设计引物，对目的片段进行PCR扩增，利用垂直聚丙烯凝胶电泳检测突变体；(10)将以上突变株系PCR产物进行纯化回收，连接T载体进行测序；(11)miR393b表达的检测；收取T₀代突变体植株种子，发苗，对T₁代植株进行纯合体筛选；提取纯合体植物叶片组织RNA，对miR393b前体进行qRT‑PCR检测分析，引物如下：osa‑miR393b‑qRT‑up:5’CGGCCTGAGGAAACTAGTGGA 3’osa‑miR393b‑qRT‑dn:5’GGAAGATGAGGAGGCGGAAG 3’产物大小:152bp(12)经miR393b表达检测为阴性的纯合株系，即为完全丧失miR393b茎环序列及其表达的水稻突变体。