[发明专利]一种抗PEG苜蓿愈伤组织再分化的方法

摘要

一种抗PEG苜蓿愈伤组织再分化的方法，本发明属于生物技术育种领域，它为了解决现有常规育种方法得到的苜蓿抗旱性较差，移栽成活率不高的问题。苜蓿愈伤组织再分化的方法：一、经NaN₃诱变和PEG胁迫处理后的苜蓿愈伤组织置于MS固体培养基中继代培养；二、块状愈伤组织接种到含有NAA和6-BA的芽分化MS培养基上进行培养，得到分化出芽的苜蓿组织；三、再将出芽的苜蓿组织放入生根培养基中培养，得到分化出根的苜蓿组织；四、苜蓿幼苗的驯化与移栽。本发明抗PEG苜蓿愈伤组织再分化的方法简便易行，移栽成活率达到90％以上，并通过此愈伤组织再分化的方法获得抗旱育种材料。

主权项

一种抗PEG苜蓿愈伤组织再分化的方法，其特征在于是通过下列步骤实现：一、将经NaN₃诱变和PEG胁迫处理后的苜蓿愈伤组织接种于MS固体培养基中,在23～25℃下培养,每日光照射12h，1000Lx光照强度，培养18～22d完成1次继代，重复继代培养多次，得到继代培养后的愈伤组织；二、将步骤一得到的继代培养后的愈伤组织分割成块状，然后接种到含有NAA和6‑BA的芽分化MS培养基上，在温度为23～25℃，每日光照射16h，2000～4000Lx光照度的条件下进行培养，得到分化出芽的苜蓿组织；三、将分化出芽的苜蓿组织在分芽处切断成两段，分段后移接到以1/2MS或MS为基本培养基的生根培养基上，在温度为23～25℃，1000～2000Lx的光照度，每天光照16h的条件下在培养瓶中进行培养，得到分化出根的无菌苗；四、当分化出根的无菌苗长到2～3cm并有4～5条粗壮根系时，在培养室内将培养瓶口打开，进行2～5d的炼苗，然后挑选株高为4～5cm，并有4～5条粗壮根系的幼苗移栽到营养土中进行培养，完成抗PEG苜蓿愈伤组织的再分化；其中步骤二所述的芽分化MS培养基为MS+2.0mg/L 6‑BA+0.2mg/L NAA+30g/L蔗糖+10g/L琼脂；当步骤三所述的生根培养基以1/2MS为基本培养基时，生根培养基为1/2MS+0.15mg/L NAA+30g/L蔗糖+30g/L琼脂+0.5g/L活性炭或1/2MS+0.05mg/L NAA+1.5mg/L IBA+30g/L蔗糖+10g/L琼脂+0.5g/L活性炭；当步骤三所述的生根培养基以MS为基本培养基时，生根培养基中含有0.05～0.10mg/L NAA、1.0～1.5mg/L IBA、0～2mg/L 6‑BA、30g/L蔗糖、30g/L琼脂、0.5g/L的活性炭和15ml铁盐母液，其中所述的铁盐母液是将2～3gFeSO₄·7H₂O和3～4g Na₂‑EDTA溶于1L去离子水中得到的。