[发明专利]一种凝集素蛋白寡聚复合体的构建方法及其应用

摘要

本发明属于生物工程领域，公开了一种凝集素蛋白寡聚复合体的构建方法及其应用，将至少两个凝集素蛋白单体的核酸序列克隆并串联连接至蛋白表达载体的多克隆位点中构建凝集素蛋白寡聚复合体的重组表达载体，由所述重组表达载体进行表达获得凝集素蛋白寡聚复合体。本发明核心内容是将凝集素蛋白单体通过分子生物学和基因工程技术改造成为凝集素蛋白寡聚复合体。本发明通过凝血实验效果检测证明：所述凝集素蛋白寡聚复合体和原单体蛋白相比具有显著增强的凝血活性，且其效果随复合体中单体数目的增加而增加，表明所述各凝集素蛋白寡聚复合体具有更强的结合糖链的能力。本发明利用基因工程手段克隆构建并表达了凝集素蛋白寡聚复合体，实现了各凝集素蛋白寡聚复合体的大量重组表达。

主权项

1.一种凝集素蛋白寡聚复合体的构建方法，其特征在于将至少两个凝集素蛋白单体的核酸序列克隆并串联连接至蛋白表达载体的多克隆位点中构建凝集素蛋白寡聚复合体的重组表达载体，由所述重组表达载体进行表达获得凝集素蛋白寡聚复合体；所述的凝集素蛋白寡聚复合体为凝集素蛋白单体按串联顺序排列的凝集素蛋白二聚体、凝集素蛋白三聚体、凝集素蛋白四聚体及四个以上凝集素蛋白单体组成的复合体，且各凝集素蛋白单体之间具有间隔序列；所述凝集素蛋白二聚体的重组表达载体为将两个凝集素蛋白单体的核酸序列插入到蛋白表达载体的NdeI、BamHI和XhoI三个酶切位点之间，所述凝集素蛋白三聚体的重组表达载体为将三个凝集素蛋白单体的核酸序列插入到蛋白表达载体的NdeI、BamHI、EcorI和XhoI四个酶切位点之间，所述凝集素蛋白四聚体的重组表达载体为将四个凝集素蛋白单体的核酸序列插入到蛋白表达载体的NdeI、BamHI、EcorI、SacI和XhoI五个酶切位点之间；所述的凝集素蛋白二聚体为MVN‑Di2、MVN‑Di6和MVN‑Di10；所述的凝集素蛋白三聚体为MVN‑Tri2、MVN‑Tri6和MVN‑Tri10；所述的凝集素蛋白四聚体为MVN‑Tetra2，MVN‑Tetra6和MVN‑Tetra10；上述各凝集素蛋白寡聚复合体的重组表达载体的构建过程为：表达所述凝集素蛋白二聚体MVN‑Di2的重组表达载体：以SEQ ID No. 1所示的MVN基因序列为模板采用两对引物MVN‑NdeI For/MVN‑BamHI2 Rev、MVN‑BamHI2 For/MVN‑XhoI Rev进行扩增分别获得带有NdeI和BamHI酶切位点的目的基因片段和带有BamHI和XhoI酶切位点的目的基因片段，将带有NdeI和BamHI酶切位点的目的基因片段双酶切后连接至pET‑30a载体，构建MVN‑Di2中间载体Ⅰ；将带有BamHI和XhoI酶切位点的目的基因片段双酶切后连接至MVN‑Di2中间载体Ⅰ构建成表达所述二聚体MVN‑Di2的重组表达载体；表达所述凝集素蛋白二聚体MVN‑Di6的重组表达载体：以SEQ ID No. 1所示MVN基因序列为模板采用两对引物MVN‑NdeI For/MVN‑BamHI6 Rev、MVN‑BamHI6 For/MVN‑XhoI Rev进行扩增分别获得带有NdeI和BamHI酶切位点的目的基因片段和带有BamHI和XhoI酶切位点的目的基因片段，将带有NdeI和BamHI酶切位点的目的基因片段双酶切后连接至pET‑30a载体，构建MVN‑Di6中间载体Ⅰ；将带有BamHI和XhoI酶切位点的目的基因片段双酶切后连接至MVN‑Di6中间载体Ⅰ构建成表达所述二聚体MVN‑Di6的重组表达载体；表达所述凝集素蛋白二聚体MVN‑Di10的重组表达载体：以SEQ ID No. 1所示MVN基因序列为模板采用两对引物MVN‑NdeI For/MVN‑BamHI10 Rev、MVN‑BamHI10 For/MVN‑XhoI Rev进行扩增分别获得带有NdeI和BamHI酶切位点的目的基因片段和带有BamHI和XhoI酶切位点的目的基因片段，将带有NdeI和BamHI酶切位点的目的基因片段双酶切后连接至pET‑30a载体，构建MVN‑Di10中间载体Ⅰ；将带有BamHI和XhoI酶切位点的目的基因片段双酶切后连接至MVN‑Di10中间载体Ⅰ构建成表达所述二聚体MVN‑Di10的重组表达载体；表达所述凝集素蛋白三聚体MVN‑Tri2的重组表达载体：以SEQ ID No. 1所示MVN基因序列为模板采用两对引物MVN‑BamHI2 For/MVN‑EcorI2 Rev、MVN‑EcorI2 For/MVN‑XhoI Rev进行扩增分别获得带有BamHI和EcorI酶切位点的目的基因片段和带有EcorI和XhoI酶切位点的目的基因片段，将带有BamHI和EcorI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至所述的MVN‑Di2中间载体Ⅰ，构建MVN‑Tri2中间载体Ⅱ，将带有EcorI和XhoI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至MVN‑Tri2中间载体Ⅱ，构建成表达所述三聚体MVN‑Tri2的重组表达载体；表达所述凝集素蛋白三聚体MVN‑Tri6的重组表达载体：以SEQ ID No. 1所示MVN基因序列为模板采用两对引物MVN‑BamHI6 For/MVN‑EcorI6 Rev、MVN‑EcorI6 For/MVN‑XhoI Rev进行扩增分别获得带有BamHI和EcorI酶切位点的目的基因片段和带有EcorI和XhoI酶切位点的目的基因片段，将带有BamHI和EcorI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至所述的MVN‑Di6中间载体Ⅰ，构建MVN‑Tri6中间载体Ⅱ，将带有EcorI和XhoI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至MVN‑Tri6中间载体Ⅱ，构建成表达所述三聚体MVN‑Tri6的重组表达载体；表达所述凝集素蛋白三聚体MVN‑Tri10的重组表达载体：以SEQ ID No. 1所示MVN基因序列为模板采用两对引物MVN‑BamHI10 For/MVN‑EcorI10 Rev、MVN‑EcorI10 For/MVN‑XhoI Rev进行扩增分别获得带有BamHI和EcorI酶切位点的目的基因片段和带有EcorI和XhoI酶切位点的目的基因片段，将带有BamHI和EcorI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至所述的MVN‑Di10中间载体Ⅰ，构建MVN‑Tri10中间载体Ⅱ，将带有EcorI和XhoI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至MVN‑Tri10中间载体Ⅱ，构建成表达所述三聚体MVN‑Tri10的重组表达载体；表达所述凝集素蛋白四聚体MVN‑Tetra2的重组表达载体：以SEQ ID No. 1所示MVN基因序列为模板采用两对引物MVN‑EcorI2 For/MVN‑SacI2 Rev、 MVN‑SacI2 For/MVN‑XhoI Rev进行扩增分别获得带有EcorI3和SacI酶切位点的目的基因片段和带有SacI和XhoI酶切位点的目的基因片段，将带有EcorI3和SacI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至所述的MVN‑Tri2中间载体Ⅱ，构建MVN‑Tetra2中间载体Ⅲ，将带有SacI和XhoI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至MVN‑Tetra2中间载体Ⅲ，构建成表达所述四聚体MVN‑Tetra2的重组表达载体；表达所述凝集素蛋白四聚体MVN‑Tetra6的重组表达载体：以SEQ ID No. 1所示MVN基因序列为模板采用两对引物MVN‑EcorI6 For/MVN‑SacI6 Rev、 MVN‑SacI6 For/MVN‑XhoI Rev进行扩增分别获得带有EcorI3和SacI酶切位点的目的基因片段和带有SacI和XhoI酶切位点的目的基因片段，将带有EcorI3和SacI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至所述的MVN‑Tri6中间载体Ⅱ，构建MVN‑Tetra6中间载体Ⅲ，将带有SacI和XhoI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至MVN‑Tetra6中间载体Ⅲ，构建成表达所述四聚体MVN‑Tetra6的重组表达载体；表达所述凝集素蛋白四聚体MVN‑Tetra10的重组表达载体：以SEQ ID No. 1所示MVN基因序列为模板采用两对引物MVN‑EcorI10 For/MVN‑SacI10 Rev、 MVN‑SacI10 For/MVN‑XhoI Rev进行扩增分别获得带有EcorI3和SacI酶切位点的目的基因片段和带有SacI和XhoI酶切位点的目的基因片段，将带有EcorI3和SacI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至所述的MVN‑Tri10中间载体Ⅱ，构建MVN‑Tetra10中间载体Ⅲ，将带有SacI和XhoI酶切位点的目的基因片段酶切后连接至MVN‑Tetra10中间载体Ⅲ，构建成表达所述四聚体MVN‑Tetra10的重组表达载体；所述引物的序列分别为：