[发明专利]一种筛选甘蔗耐旱变异株的方法

摘要

本发明为一种筛选甘蔗耐旱变异株的方法，属于甘蔗分子育种技术领域，具体涉及的是一种耐旱甘蔗植株的选育方法。一种耐旱甘蔗植株的选育方法，用适合的斑茅总DNA溶液浓度共培养甘蔗胚性悬浮小细胞，将培养物培养在不同浓度PEG的MS培养基上，在愈伤组织的增殖、分化等进行反复抗旱筛选，并经过SRAP分子检测变异株，最后经过温室大棚抗旱胁迫的选择，最终选育出抗旱的甘蔗植株。本发明的方法缩短了甘蔗选育的时间，且操作简单、价格廉价，同时提供一种突破甘蔗属、种的近缘杂交新途径，所获得的甘蔗植株比对照具有更好的耐旱特性。

主权项

一种筛选甘蔗耐旱变异株的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)甘蔗的愈伤组织培养：将长至10‑20cm蔗芽取下消毒灭菌后接种到诱导培养基上诱导愈伤组织，每瓶接4‑5圆片，先暗培养，连续培养10d，后进行光照培养10h/天，连续培养15d，得到愈伤组织；(2)甘蔗的胚性愈伤培养：将步骤(1)中得到的愈伤组织转至继代培养基上进行继代增殖，继代3次，每次培养20d，光照培养10h/天，培养后挑选结构疏松、颜色淡黄的愈伤组织，结合显微镜进行选择，筛选出甘蔗胚性细胞；(3)甘蔗愈伤悬浮培养与选择：将步骤(2)中得到的甘蔗胚性细胞接种到含1.0‑3.0mg/L 2，4‑D、0.1‑0.2mg/L NAA的MS培养基中，在摇床以120rpm的转速进行震荡培养，光照培养10‑14d，将得到的细胞团块转移至离心管中以8000rpm的转速离心10min，将离心沉淀物剔除褐化、已死亡细胞及大细胞团块后转接到含2.0mg/L 2，4‑D、0.1mg/L NAA的MS培养基，在摇床上120rpm震荡培养2‑4d，得到比较分散的悬浮物，先用孔径50目细胞筛滤去较大孔径的愈伤组织，再用孔径为80‑150目的细胞筛滤，即得到直径0.10‑0.22mm的较分散的微小细胞粒；(4)斑茅总DNA与甘蔗细胞悬浮共培养：将步骤(3)中得到的微小细胞粒转移至含1.0‑2.0mg/L 2，4‑D、0.1‑0.2mg/L NAA的MS培养基上，并加入斑茅总DNA，总DNA的浓度为200‑400μg/mL，将甘蔗愈伤微小细胞粒与斑茅总DNA在摇床120rpm的转速进行悬浮共培养，先暗培养2d，再光照培养3d，得到细胞培养物；(5)将步骤(4)得到的细胞培养物转移至含有质量百分比为20％PEG、1.0mg/L 2，4‑D的MS培养基上进行光照培养7d，将培养物再转入含10％PEG、2.0mg/L 2，4‑D的MS培养基上进行光照培养10d；(6)将步骤(5)得到的细胞培养物在分化培养基上进行分化培养，光照培养分化出不定芽，培养时间20d，将芽在含30％PEG的MS培养基上再培养，光照培养20d，得到再生植株；(7)将步骤(6)获得的再生植株在生根培养基上进行生根培养，光照培养20d，经过SRAP分子检测鉴定，初步获得耐旱的甘蔗变异株试管苗；(8)将步骤(7)获得的耐旱的甘蔗变异株试管苗进行苗期水分胁迫处理，剔除不耐旱或表现不良的植株，最后获得耐旱甘蔗植株；所述的MS培养基均需添加30g/L蔗糖；所述的光照培养是指日光灯光照、光照强度为2000‑3000Lux；所述的暗培养是指全天遮光处理；所述的光照培养、暗培养的温度为26±2℃；步骤(1)中所述的消毒灭菌的具体操作为：取无病害、生长健壮的甘蔗茎稍，流水冲洗，剥去外围叶片，在超净工作台上，用解剖刀逐层剥叶，每剥1次用75％的酒精表面消毒1次，留下0‑2cm新叶，切成1‑2mm厚圆片。