[发明专利]一种石斛超低温保存脱毒的方法

摘要

本发明涉及一种石斛超低温保存脱毒的方法，属于植物病毒防治技术领域。本发明为了更有效的保护即将濒危的石斛，提高种苗质量，生产无病毒种苗，本发明提供了一种新型的石斛超低温保存脱毒方法，能有效提高种苗脱毒率。与传统的脱毒方法相比超低温脱毒具有脱毒率高，脱毒率不受茎尖大小的影响，具有取材方便，操作简单，不需要特殊的仪器、设备和昂贵的药品试剂，且周期短，可同时用于种质资源的保存与脱毒的优点，易于推广应用。

主权项

一种石斛超低温保存脱毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤（1），选择1月苗龄的带有CyMV和ORSV病毒的石斛组培苗，取石斛组培苗带有单芽的茎段1.0‑1.5cm，接种到基本培养基上，在4℃黑暗条件下炼苗3‑5周；所述1月苗龄是继代培养1月的石斛组培苗，苗高度为2‑3cm；所述基本培养基为：1/2MS+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8；步骤（2），从步骤（1）所炼的苗上剥取1‑3mm长的茎尖，然后将茎尖在4℃黑暗条件下预培养1‑3d；接着在超净工作台上，采用高糖加载液对茎尖加载20‑40min后，将茎尖转移到玻璃化溶液PVS2中脱水30‑60min，再将茎尖投入液氮中保存30min‑1h，之后将茎尖在室温下迅速转入卸载液中解冻并卸载20‑30min，或是将茎尖在37℃水浴中解冻3‑4min再转入卸载液中卸载20‑30min，卸载后的茎尖接种到成活培养基上，先暗培养1‑3d，后转入正常光照下继续培养，获得石斛脱毒苗；所述预培养的培养基为：1/2MS+0.3‑0.6mol/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8；所述加载和脱水过程都在冰上进行；所述高糖加载液为：1/2MS+2mol/L甘油+0.3‑0.7mol/L蔗糖，pH5.8；所述玻璃化溶液PVS2为：1/2MS+0.4mol/L蔗糖+30%w/v甘油+15%w/vDMSO，pH5.8；所述卸载液为：1/2MS+1.2mol/L蔗糖，pH5.8；所述成活培养基为：1/2MS+0.1‑0.2ml/L NAA+0.1‑2.0ml/L 6‑BA+50g/L马铃薯+25g/L香蕉+7g/L琼脂，pH5.8；所述正常光照培养是在温度25±1℃、光照强度1000‑2000lx、光照12h/d的条件下进行培养。