[发明专利]一种使用耐热重组HNH型核酸内切酶切割DNA的方法

摘要

本发明提供一种使用耐热重组HNH型核酸内切酶切割DNA的方法，包括以下步骤：1)以深海嗜热噬菌体GVE2基因组为模板进行PCR扩增；2)对PCR扩增产物和pET-30a载体进行双酶切反应；3)回收酶切后的PCR产物和pET-30a载体片段后进行连接反应；4)将连接产物转化到感受态细胞中后，挑取克隆，并测序验证；5)将基因序列正确的克隆质粒转化到感受态细胞中进行诱导表达；6)提取并纯化该耐热重组核酸内切酶；7)使用获得的GVE2HNH型核酸内切酶切割DNA：切割反应温度大于60℃，切割反应pH值大于5.5。该耐热重组核酸内切酶活力高，能够在大于60℃的高温条件下无特异性地切割DNA，在分子生物学、疫苗工业、蛋白和多糖类制药工业等涉及到核酸去除的催化领域有着广阔的应用前景。

主权项

一种使用耐热重组HNH型核酸内切酶切割DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)利用具有如下核苷酸序列的扩增引物，以深海嗜热噬菌体GVE2基因组为模板进行PCR扩增：正向引物为：5'‑GGA ATT CCA TAT GCC AAG CAA ACC ACT GCG ACC‑3'，反向引物为：5'‑CCG CTC GAG CCC ATA CCG TCG CTT ATC TTC CG‑3'；2)对步骤1)中得到的PCR扩增产物和pET‑30a载体进行NdeI和XhoI双酶切反应；3)回收并纯化步骤2)中所得的酶切后的PCR产物和pET‑30a载体片段后，进行酶基因与载体的连接反应；4)将步骤3)中所得的连接产物转化到感受态细胞中，随后涂布在含有卡那霉素的LB平板进行培养后挑取克隆，并提取质粒进行测序验证；5)将步骤4)中获得的基因序列正确的克隆质粒转化到感受态细胞中进行诱导表达；6)从步骤5)中所获得的细胞中提取并纯化该耐热重组核酸内切酶；7)使用步骤6)中获得的GVE2HNH型核酸内切酶切割DNA：切割反应温度大于60℃，切割反应pH值大于5.5。