[发明专利]细菌磁颗粒红细胞膜复合颗粒及其临床应用

摘要

本发明公开了一种细菌磁颗粒红细胞膜复合颗粒及其在红细胞膜抗原保存与血型抗体检测中的应用，该复合颗粒是通过将细菌磁颗粒表面‑NH2基团经过处理使其活化，与红细胞膜共同孵育，使细菌磁颗粒表面结合红细胞膜；将该细菌磁颗粒红细胞膜复合颗粒用于长期保存人红细胞膜血型抗原并用于血型抗体的检测，可为临床提供一种快速、简便的试验方法；本方法的优点在于细菌磁颗粒较化学合成的磁性粒子性能、大小更均一，来源不受限制，生物相容性更好，能够与红细胞膜牢固结合并最大限度保证红细胞膜表面血型抗原的表位活性，其制备的细菌磁颗粒红细胞膜复合颗粒，特别有利于临床红细胞血型抗原的保存及血型抗体的检测。

主权项

一种细菌磁颗粒红细胞膜复合颗粒的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：细菌磁颗粒的制备：a.将趋磁细菌MSR‑1菌株进行扩大培养；所述趋磁细菌MSR‑1菌株扩大培养包括如下步骤：a)在培养罐内加入第一培养基，105‑110℃灭菌10min，静置1h后，将趋磁细菌MSR‑1菌株接种到培养罐中，进行第一次培养，获得第一培养液；第一次培养的条件为：起始pH值为5.5‑6，培养温度为28‑30℃，培养时间为3‑5天，摇床转速为250‑300转/分钟，培养过程中通入氧气，通入氧气的方式为：间隔20min，通入50min氧气；b)将第一培养液加入含有第二培养基的培养罐中，无氧状态进行第二次培养；第二次培养的条件为：起始pH值为6.5‑7.0，培养温度为20‑25℃，培养时间为2‑3天，摇床转速为100‑200转/分钟；所述第一培养基由重量份数为5‑10份的谷氨酰胺、1‑3份麦芽糖醇、0.5‑1份泛酸钙、0.5‑1份酪蛋白酸钠、0.2‑0.5份磷酸二氢钾、0.5‑1份月桂酸肌氨酸和1‑2份氯化钠组成，所述第二培养基由重量份数为2‑3份蛋白胨、2‑5份生物素、1‑2份甘氨酸、0.5‑1份酒石酸钠、1‑2份硝酸铵、1‑2份磷酯酰丝氨酸和0.2‑0.5份月桂醇硫酸酯钠组成；b.离心并收集趋磁细菌MSR‑1菌株，用Tris‑HCl缓冲液悬浮，制得悬浮液，转速8000‑10000rpm，离心时间5‑10min；c.超声波破碎悬浮液中的细胞，超声功率250‑350w，超声时间2‑7s，间隔时间2‑7s，超声次数80‑100次，重复3次；d.磁铁吸附破碎后的细胞，静置过夜，弃去上清，用磷酸盐缓冲液重新悬浮吸附到的沉淀，超声波清洗，磁铁再次吸附，弃上清，将吸附到的沉淀用磷酸盐缓冲液悬浮，洗涤3次，即得细菌磁颗粒，超声波清洗条件为：超声功率70‑90w，超声时间2‑7s，间隔时间2‑7s，超声次数40‑60次；1)活化：细菌磁颗粒处理：(1)取细菌磁颗粒，加入处理剂搅拌条件下反应，反应完成后将产物洗涤至中性；所述处理剂为体积比是40‑60：1‑3：0.3‑1的无水乙醇、氨水和正硅酸乙酯的混合液；(2)将步骤(1)反应后得到的细菌磁颗粒配成浓度为0.1％～0.3％的溶液，调节溶液pH值至3.0‑5.0，向上述溶液中加入浓度为5‑15％的3‑氨丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液中，搅拌条件下反应，反应完成后将产物洗涤至中性，制得经过处理的细菌磁颗粒；(3)取经过处理的细菌磁颗粒，加入偶联剂混合物，搅拌反应，过滤，所述偶联剂为质量比为1:1‑1.2的EDC和NHS的混合物，制得活化后的细菌磁颗粒；2)孵育：将活化后的细菌磁颗粒与红细胞膜混合，加入孵育剂，孵育剂重量份数比为2:5.5‑7.2：2‑3的壳聚糖、海藻酸钠和聚乙二醇4000的混合物，140‑160rpm涡旋振荡，室温孵育，反应过夜；3)磁铁吸附并洗涤，收集沉淀，即得细菌磁颗粒红细胞膜复合颗粒。