[发明专利]一种利用荧光辅助糖电泳对玉米芯木聚糖酶解产物分析鉴定不同木聚糖酶功能的方法

摘要

本发明公开了一种利用荧光辅助糖电泳对玉米芯木聚糖酶解产物分析鉴定不同木聚糖酶功能的方法，包括如下步骤：(1)利用玉米芯制备粒径均一超细的玉米芯木聚糖粉，获得玉米芯木聚糖；(2)用不同待鉴定木聚糖酶酶解玉米芯木聚糖；(3)利用荧光辅助糖电泳对玉米芯木聚糖酶解产物分析；(4)根据对玉米芯木聚糖酶解产物分析结果判定待测木聚糖酶功能的差异。本发明的方法利用设备便宜、分析成本低的荧光辅助糖电泳可以有效的筛选出具有明确功能的木聚糖酶，避免了具有不同功能的木聚糖酶的盲目使用，在利用玉米芯等复杂生物质降解生产木寡糖和木糖的过程中具有广阔的应用前景。

主权项

一种利用荧光辅助糖电泳对玉米芯木聚糖酶解产物分析鉴定不同木聚糖酶功能的方法，步骤是：(1)利用玉米芯制备粒径均一超细的玉米芯木聚糖粉，获得玉米芯木聚糖；(2)用不同待鉴定木聚糖酶对玉米芯木聚糖实施酶解；(3)利用荧光辅助糖电泳对玉米芯木聚糖酶解产物分析；(4)根据对玉米芯木聚糖酶解产物分析结果判定待鉴定木聚糖酶功能的差异；其特征在于：步骤(1)所述利用玉米芯制备粒径均一超细的玉米芯木聚糖粉的方法是：①将烘干后的玉米芯粉碎成粒径为0.2±0.1mm的颗粒，过80目筛子，获得粒径均一的玉米芯粉；②将制得的粒径均一的玉米芯粉按质量体积比1:8‑9的比例加入蒸馏水，于105±2℃预处理40‑50min，然后用8层纱布过滤，收集滤渣；③将滤渣烘干后研磨1‑2h；④研磨后加入与①所述蒸馏水体积相同量的浓度为15％(w/v)的氢氧化钠溶液，于115±2℃下蒸煮40‑50min，然后用8层纱布过滤，收集滤液；⑤滤液用浓度为30％(w/v)的氢氧化钠溶液对其进行脱色处理0.5‑1h；⑥脱色处理后的溶液用浓度为15％(w/v)的三氯乙酸溶液脱蛋白，其中所述溶液与三氯乙酸溶液的体积比为8:1；⑦将脱蛋白后的溶液以8000r/min离心30min，收集上清液，然后加入浓盐酸将该溶液的pH调至6.0；⑧加入⑦制得的溶液3倍体积量的无水乙醇，醇沉12‑20h，然后8000r/min离心20min，收集的沉淀物即为木聚糖粗提物；⑨将木聚糖粗提物用三蒸水充分搅拌清洗，再8000r/min离心20min，收集沉淀物，如此重复3次；⑩将⑨制得的沉淀物于‑20℃冷冻干燥12‑20h，得到纯木聚糖粉末，再研磨1.5‑3h，研磨后的粉末过100～200目筛子，即得到粒径均一超细的聚合度在40‑100范围内的玉米芯木聚糖；步骤(2)所述用不同待鉴定木聚糖酶对玉米芯木聚糖实施酶解的方法是：①利用磷酸氢二钠/柠檬酸缓冲液将步骤(1)制得的玉米芯木聚糖配成浓度为1％的且pH适于待鉴定木聚糖酶反应的木聚糖溶液；②将制备的木聚糖溶液与蛋白浓度为0.01mg/mL的待鉴定木聚糖酶溶液按体积比为6:4混合，在该待鉴定木聚糖酶的最适温度条件下分别进行时间为2min、5min、15min、30min、60min、120min、240min的序列反应，其间以沸水作用10min终止反应，分别以10000r/min离心10min，收集各时间段的待鉴定木聚糖酶对玉米芯木聚糖实施酶解的产物；步骤(3)所述利用荧光辅助糖电泳对玉米芯木聚糖酶解产物分析方法是：①分别取步骤(2)制得的待鉴定木聚糖酶对玉米芯木聚糖实施酶解的产物进行荧光标记，然后分别取制备的荧光标记产物0.2μg～5μg点样，在冰水浴条件下，以恒流5mA/胶板进行荧光辅助糖电泳，时间3‑4h；②利用荧光成像系统对荧光辅助糖电泳凝胶扫描，获得TIF格式图片，提取图片中各条带灰度值以此定量分析待鉴定木聚糖酶对玉米芯木聚糖各时间段实施酶解产物中相应的各寡糖的量；其中，所述荧光辅助糖电泳中聚丙烯酰胺分离胶、浓缩胶中各组分及浓度是：聚丙烯酰胺分离胶配方：35％丙烯酰胺，375mM、pH 8.8Tris‑HCl，0.1％过硫酸铵以及0.02％TEMED；聚丙烯酰胺浓缩胶配方：5％丙烯酰胺，62.5mM、pH 6.8Tris‑HCl，0.1％过硫酸铵以及0.02％TEMED；分离胶加入量为4.1mL/胶板；步骤(4)所述根据对玉米芯木聚糖酶解产物分析结果判定待鉴定木聚糖酶功能的差异的方法是：根据对玉米芯木聚糖酶解产物分析结果进行判定，若能将玉米芯木聚糖中木寡糖在2min之内迅速转化成木糖的即鉴定该木聚糖酶含有β‑木糖苷酶；若能将玉米芯木聚糖中木聚糖在2min之内迅速降解为木寡糖，而木寡糖在240min内被缓慢降解为木糖及短寡糖的即鉴定该木聚糖酶含有内切木聚糖酶；若在玉米芯木聚糖酶解产物中检测到带有甲基化葡萄糖醛酸侧链的木三糖并且其含量随时间序列反应逐渐增加后趋于稳定的即鉴定该木聚糖酶归于CAZy数据库(http://www.cazy.org/)中糖苷水解酶10家族的木聚糖酶；若在玉米芯木聚糖酶解产物中仅检测到带有甲基化葡萄糖醛酸侧链的木四糖并且其含量随时间序列反应逐渐增加后趋于稳定的即鉴定该木聚糖酶归于CAZy数据库(http://www.cazy.org/)中糖苷水解酶11家族的木聚糖酶。