[发明专利]一种基于QTL-seq发掘东乡野生稻耐冷基因的方法

摘要

本发明公开了一种基于QTL‑seq发掘东乡野生稻耐冷基因的方法。本发明以栽培稻‘协青早B’为受体亲本为母本，东乡野生稻为父本，远缘杂交后连续回交自交获得的重组自交系BC1F10进行耐冷鉴定，获得20耐冷株系组成耐冷基因池，20个冷敏感株系组成的冷敏感基因池。对两个基因池进行高通量测序及QTL‑seq分析，获得两个基因池的差异SNP标记和耐冷性状相关的QTL位点，对候选耐冷基因进行荧光定量PCR检测，最后鉴定检测到东乡野生稻中有5个耐冷相关基因。本发明可快速准确地探明和发掘东乡野生稻耐冷基因，可为全面阐明东乡野生稻耐冷性状的遗传机理提供有力证据，为东乡野生稻耐冷基因的克隆、功能分析奠定基础，促进东乡野生稻耐冷基因用于育种实践。

主权项

一种基于QTL‑seq发掘东乡野生稻耐冷基因的方法，其特征在于：（1）耐冷性状极端分离混合基因池的构建：以栽培稻‘协青早B’为受体亲本为母本，东乡野生稻为父本进行远缘杂交，经回交和连续自交获得重组自交系BC₁F₁₀，经耐冷鉴定获得20株强耐冷株系，20个冷敏感的株系，分别收集个株系等量的新鲜叶片，将强耐冷株系等量混合组成耐冷基因池，简称R池；将冷敏感株系株系等量混合组成冷敏感基因池，简称S池，用CTAB法提取两个混池的基因组DNA，用琼脂糖电泳的方法检测混池DNA的浓度和纯度，技术指标：R池的活苗率80%以上，S池的活苗率低于20%，DNA浓度和纯度达到基因组文库构建要求；（2）基因组文库的构建：检测合格的DNA样品用Covaris超声波破碎仪随机打断成长度为350bp的片段，经末端修复、加A尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库的构建，随后先使用Qubit2.0进行初步定量，稀释文库至1ng/ul，再使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测，insert size符合预期后，使用Q‑PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量，以保证文库质量，库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求进行分型后采用Illumina HiSeq 2500进行测序，技术指标：文库有效浓度＞2nM；（3）耐冷性状极端分离混池的高通量测序：Illumina HiSeq^TM2500/Miseq^TM得到的原始图像数据文件经CASAVA碱基识别分析转化为原始测序序列，我们称之为Raw Data或Raw Reads，结果以FASTQ件格式存储，其中包含测序reads的序列信息以及其对应的测序质量信息，本次测序R池产生的Raw data 为10.933 G，过滤后的Clean data 为10.785G；S池的Raw data 11.153 G，过滤后的Clean data 11.019 G，Q20 >= 94.3%，Q30 >= 89.4%，GC含量在42.77‑45.06%之间，各样品的测序质量合格，数据量足够，GC分布正常，建库测序成功，技术指标：每个样品的raw data测序量不低于10 G，GC含量需在35‑65%正常范围内，Q₂₀>85%；（4）SNP 过滤及SNP‑index绘图：将耐冷池和冷敏感池获得的测序序列与极端耐冷亲本东乡野生稻进行比对，获得两个混池子代与亲本间的SNP标记1,290,297个，计算R池和S池的SNP‑index，SNP‑index是指某个SNP位点含有SNP的reads数占该位点所有read数的比例，混池子代与东乡野生稻完全相同的 SNP‑index为0；完全与其不同的SNP‑index为1，过滤掉可靠性不高的SNP，绘制了耐冷池和冷敏感池的SNP‑index图谱，技术指标：过滤掉两个子代中SNP‑index都小于0.3，并且SNP深度都小于7的SNP位点，另外还过滤掉一个子代SNPindex缺失的SNP位点；（5）两极端混池的Δ(SNP‑index)计算及其图谱绘制：按照绘制SNP‑index图的方法绘制两极端混池的Δ(SNP‑index)图谱，其中Δ(SNP‑index)是耐冷池和冷敏感池中每个SNP的SNP‑index的差值；（6）耐冷候选SNP位点筛选及耐冷性状的定位：选取99%置信水平作为筛选的阈值，分析两个子代SNPindex差异显著的区域，进行1000次置换检验，挑选冷敏感S池中SNPindex接近1，并且耐冷R池的SNPindex接近0的位点，符合这些特点的区域就可能为与耐冷性状相关的QTL位点，在99%置信水平下发现候选区域主要位于12号染色体上，在该区域共挑选出2333个SNP位点，对于12号染色体上的2,333个候选的多态性标记位点，提取ANNOVAR的注释结果，其中有24个SNP非同义突变位点位于基因上，1个在stop loss上，涉及17个基因，在其他染色体上276个SNP位点，涉及9个基因，技术指标：99%置信水平作为筛选的阈值，Δ(SNP‑index)接近1；（7）荧光定量PCR鉴定：参照Invitrogen 公司的TRIZOL试剂使用说明书分别提取东乡野生稻和协青早B的总RNA，同时参照Promega公司的 Frist‑Strand Synthesis of cDNA 试剂盒说明书合成cDNA，根据候选SNP所涉及基因的编码序列，利用Primer 3.0在线设计荧光定量PCR引物，以水稻肌动蛋白Actin基因作为内标检测基因，检测候选基因的在亲本之间的表达量，荧光定量PCR分析表明，有5个基因在亲本之间表达差异明显，实验重复好，这5个基因分别为8号染色体上的Os08CR，9号染色体上的OS09CR，以及12号染色体上的OS12CR‑1，OS12CR‑2和OS12CR‑3，技术指标：荧光定量PCR重复性好，亲本间的差异表达稳定。