[发明专利]一种制备拥有类似天然状态生理功能的蜈蚣多肽毒素SSD609的方法

摘要

本发明涉及一种制备拥有类似天然状态生理功能的蜈蚣多肽毒素SSD609的方法。该方法是通过基因合成方法制备SSD609多肽毒素的DNA序列，用PCR方法在其前面插入Factor‑Xa酶切位点，并克隆至带有His₆亲和标签和SUMO助溶标签的pET28载体上。将质粒转化进入大肠杆菌，异丙基硫代半乳糖苷诱导高效表达。细菌破碎后使用镍柱进行纯化，并用Factor‑Xa酶切断His₆‑SUMO融合标签和SSD609，反挂镍柱除去His₆‑SUMO。SSD609用HPLC进一步纯化后，加入一定比例的GSH和GSSG，使SSD609中二硫键重新连接成热力学稳定的状态，构象变得均一。再次用HPLC纯化SSD609，冻干后备用。本发明所提供的制备SSD609方法操作简便，产量多，纯度高，成本较低，且拥有类似天然状态下SSD609的生理功能，可用于该蜈蚣毒素的大量制备。

主权项

1.一种制备拥有类似天然状态生理功能的蜈蚣多肽毒素SSD609的方法，包括如下步骤：（1）获取SSD609蛋白的DNA序列，所述DNA序列如SEQ ID No.1所示；（2）将SSD609的DNA序列连接到带有His6亲和标签和SUMO助溶标签的pET28载体上，构建pET28‑His6‑SUMO‑Factor Xa‑SSD609质粒；（3）将pET28‑His6‑SUMO‑Factor Xa‑SSD609质粒转化进入大肠杆菌，培养后采用异丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl‑β‑D‑thio‑galactoside，IPTG)诱导表达，离心后收菌；（4）将细菌悬液超声破碎后离心取上清液，用镍柱纯化，洗脱后得到纯化的His6‑SUMO‑ SSD609融合蛋白；（5）His6‑SUMO‑ SSD609融合蛋白用Factor Xa酶进行酶切，得到含有His6‑SUMO标签和SSD609多肽毒素的蛋白混合液；将该混合液与镍柱混合，His6‑SUMO标签与镍柱结合，而SSD609多肽毒素则作为流穿液被收集，并用HPLC进一步纯化；（6）经HPLC纯化后的SSD609多肽毒素使用还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽进行二硫键重建，获得状态均一的SSD609多肽毒素；（7）再次使用HPLC对SSD609多肽毒素进行纯化，并质谱验证SSD609的分子量大小，冻干备用。