[发明专利]一种形态学与分子生物学相结合鉴定贝类种质的方法

摘要

本发明涉及一种海水养殖贝类的种类鉴定技术领域，尤其是一种利用形态学和分子遗传学技术对贝类样品进行种类鉴定的方法，该方法采用分子生物学方法与形态学方法相结合的方法对贝类进行鉴定，通过分子生物学方法对具有一定形态特征的贝类样品进行准确鉴定，总结可用于种类鉴定的形态特征，建立形态特征检索表，再利用形态特征检索表对其他样品进行种类识别，并采用分子生物学方法进行验证，能显著提高贝类种质资源鉴定的准确率，解决先前种类鉴定的诸多难点。

主权项

一种形态学与分子生物学相结合鉴定贝类种质的方法，其特征在于，包括以下步骤：①将可以准确鉴定种类的贝类样品保存于70％乙醇溶液中，常规方法提取DNA，扩增线粒体DNA的COI片段并测序，通用引物序列LCO1490：5′‑GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG‑3′HCO2198：5′‑TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA‑3′②将采集的样品保存于4％的福尔马林溶液中，③样品形态学鉴定，在解剖镜下将不能准确确定种类的样品依据形态特征归类，从每一类中选取具有代表性的个人进行显微拍照，记录形态特征，该形态特征包括壳高、壳长、壳宽、总重、壳重、壳厚、背缘长、外韧带长、壳顶宽、放射肋宽、绞合齿数、放射肋条数，④分子生物学鉴定，将选出的样品提取DNA，扩增线粒体DNA的COI基因片段并测序，将测序结果与BOLD Systems Animal identification[COI]进行数据比对，确定该种贝类的分类学地位，并建立Barcoding数据库，(1)DNA提取a)切取贝类组织50～100mg，放入1.5mL灭菌离心管中用剪刀剪碎；b)加裂解液500μL再加入5μL蛋白酶K，上下颠倒混匀，40℃水浴槽内消化过夜；c)加入体积比为25∶24∶1的酚、氯仿、异戊醇混合液500μL，放于旋转培养器中混匀20min；d)室温离心15min，5000r/min，用移液枪吸取上清液于另一离心管内；e)重复c～d步骤3次；f)加入与上清液等体积的氯仿∶异戊醇混合液，置于旋转培养器混匀20min，该氯仿∶异戊醇混合液的体积比为24∶1；g)室温离心15min，5000r/min，用移液枪吸取上清液于另一离心管中；h)重复f～g步骤3次；i)向得到的上清液中加入10μL醋酸钠，再加入2.5倍上清液体积的无水乙醇，颠倒混匀，无水乙醇于‑20℃预冷处理；j)将步骤i中的混合液放置于‑20℃过夜；k)4℃离心，12000r/min，15min后倒掉上清液加70％乙醇1000μL，12000r/min，1min离心；l)重复上述步骤k一次；m)倒掉上清液加无水乙醇1000μL，12000r/min，1min离心，倒掉上清液，风干；n)加入50～100μL TE缓冲液，溶解DNA；(2)目的片段的扩增PCR反应体系为15μL，包含100ng模板DNA，1×PCR缓冲液，0.4U Taq DNA聚合酶，2.5mM MgCl₂，0.25mM dNTP混合液，上下游引物各0.7μM，灭菌的双蒸水将体系补至15μL。PCR扩增条件为：94℃预变性5min，然后30个循环，每个循环包括3个步骤：94℃30S；49～56℃退火30S；72℃延伸45S，PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳，DL2000DNA Marker作为检测产物大小，凝胶成像仪拍照，读取PCR扩增结果；(3)目的片段测序及比对将符合预期长度大小的PCR扩增产物进行测序，将测序结果进行拼接后，与贝类的在线数据库BOLD Systems Animal identification[COI]进行比对，确定该贝类的分类学地位。