[发明专利]细胞毒性T细胞脱颗粒的流式细胞术检测方法

摘要

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种细胞毒性T细胞脱颗粒的流式细胞术检测方法，包括通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用激发细胞毒性T细胞脱颗粒，再用流式细胞术检测激发后与激发前细胞毒性T细胞中囊泡膜蛋白标志物CD107a的平均荧光强度的比值来评价细胞毒性T细胞的脱颗粒功能，若比值≥2.8提示脱颗粒功能正常。本申请提供的细胞毒性T细胞脱颗粒的流式细胞术检测方法，检测快速，通量大，准确度高，且人为因素影响较小。通过对天然刺激物的选择、效靶细胞配比及孵育时间等关键技术细节进行优选限定，建立了稳定规范的技术流程。

主权项

一种细胞毒性T细胞脱颗粒的流式细胞术检测方法，其特征在于，包括：通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用激发细胞毒性T细胞脱颗粒，再用流式细胞术检测激发后与激发前细胞毒性T细胞中囊泡膜蛋白标志物CD107a的平均荧光强度的比值来评价细胞毒性T细胞的脱颗粒功能，若比值≥2.8提示脱颗粒功能正常；所述的检测方法具体包括以下步骤：1)、分离待检样本中的外周血单个核细胞及并计数调整细胞浓度至1.8～2.2×106/ml；2)、取P815细胞并计数调整细胞浓度至1.8～2.2×106/ml；3)、将步骤1)中的所述外周血单个核细胞和步骤2)中的所述P815细胞按体积比等比混合后平均分成两组，向其中一组中加入抗人CD3抗体作为实验组，另一组作为对照组；将两组于37℃，5％CO2培养箱中共孵育2.5～3.5h后离心并弃上清，得到沉淀；抗人CD3抗体的浓度为0.25～0.5μg/100μl；4)、加入流式染色缓冲液重悬步骤3)中所述沉淀，同时加入抗CD3、CD8、CD107a的流式抗体并孵育；在步骤4)中，CD3、CD8的抗体的浓度为0.45～1.0μg/100μl；CD107a的抗体浓度为0.06～0.125μg/100μl；5)、待孵育完成后离心，用流式染色缓冲液洗涤沉淀；6)、洗涤后用流式染色缓冲液重悬混匀细胞并用流式细胞仪进行检测；7)、统计CD3+CD8+的细胞中CD107a的平均荧光强度，并计算实验组与对照组的平均荧光强度的比值用以评价细胞毒性T细胞的脱颗粒功能，若比值≥2.8提示脱颗粒功能正常。