[发明专利]基于化学修饰和同位素标记多肽氨基酸序列从头测序方法

摘要

本发明涉及一种基于化学修饰改性和同位素标记的多肽氨基酸序列从头测序方法。利用N端和C端标记后的多肽分子质量以及保留时间的相关性，将不同标记的相同多肽的二级质谱图进行关联。利用不同标记样品中多肽在质谱碎裂过程中形成的N端和C端碎片离子对，对多肽氨基酸序列进行从头测序。本发明通过对多肽使用带有正电荷的试剂进行修饰改性，有利于多肽在质谱中碎裂时形成丰富的碎片离子；同时，通过使用含有不同轻重同位素的试剂进行标记，多肽在质谱中碎裂时形成成对存在的碎片离子，易于分辨，从而降低干扰信号的影响，提高碎片离子选择特异性以及从头测序的速度；利用N端和C端碎片离子的互补性，提高多肽测序准确度和效率。

主权项

1.基于化学修饰和同位素标记多肽氨基酸序列从头测序方法，其特征在于：将待测多肽样品分成两份；对第一份样品，使用化学标记的方法对多肽N端的α‑氨基进行标记；在进行标记时，将第一份样品分成等量的两份，分别使用含有不同同位素的带有正电荷的轻标记试剂、重标记试剂进行标记，使其中一份样品中的多肽N端采用轻标记试剂进行标记，使另一份样品中的多肽N端采用重标记试剂进行标记，且使得二份样品间轻重标记的相同肽段的分子量相差在0到8Da之间，且不为0；将标记后的二份样品混合，使用液相色谱‑质谱联用进行分离和鉴定；在质谱鉴定时，将分离窗口设置为2‑8 Da，使得不同标记的多肽同时碎裂；根据同位素标记引起的多肽碎片离子质量差异鉴别N端b离子；对第二份样品，使用化学标记的方法对多肽C端的羧基进行标记；在进行标记时，将第二份样品分成等量的两份，分别使用含有不同同位素的带有正电荷的轻标记试剂、重标记试剂进行标记，使其中一份样品中的多肽C端采用轻标记试剂进行标记，使另一份样品中的多肽C端采用重标记试剂进行标记，且使得二份样品间轻重标记的相同肽段的分子量相差在在0至8Da之间，且不为0；将标记后的二份样品混合，使用一维或者二维液相色谱‑质谱联用进行分离和鉴定；在质谱鉴定时，将分离窗口设置为2‑8 Da，使得不同标记的多肽同时碎裂；根据同位素标记引起的多肽碎片离子质量差异鉴别C端y离子；对多肽N端和C端分别进行标记时，使用分子质量和疏水性类似的标记试剂；利用N端和C端标记后的多肽分子质量以及保留时间的相关性找出N端和C端分别被标记的相同多肽的二级质谱图；结合鉴定到的多肽b离子和y离子，分别对待测多肽样品中的每一肽段进行多肽氨基酸序列从头测序分析。