[发明专利]一种镉‑高密度脂蛋白螯合物及其制备方法和应用

摘要

本发明提供一种镉‑高密度脂蛋白螯合物及其制备方法和应用，该镉‑高密度脂蛋白螯合物是镉离子与高密度脂蛋白通过巯基或/和半胱氨酸残基螯合而成，可用于制备检测人体镉‑高密度脂蛋白螯合物的试剂。本发明首次证实了镉离子可直接作用于高密度脂蛋白。本发明建立了镉‑高密度脂蛋白螯合物的定性定量检测方法，以检测一个地区人群体内高密度脂蛋白的含量，从而间接反映一个地区镉污染程度以及对人群的健康影响。本发明建立的镉‑高密度脂蛋白螯合物定量检测方法准确度高重、复性好。

主权项

一种镉‑高密度脂蛋白螯合物，其特征在于，该镉‑高密度脂蛋白螯合物是镉离子与高密度脂蛋白通过巯基或/和半胱氨酸残基螯合而成；所述的镉‑高密度脂蛋白螯合物的制备方法，包括以下步骤：A）镉‑高密度脂蛋白的合成：在提纯源于人体的高密度脂蛋白或按照生物学方法重组的高密度脂蛋白中加入镉离子进行螯合反应，得到反应溶液；具体操作步骤如下；1）取2.0mg ITCBE溶于2mLDMSO中；2）缓慢将步骤1）制备的液体加入高密度脂蛋白溶液中，边滴加边震荡，于25℃，100r/min的摇床中作用24h，然后用透析袋透析24h，除去未与高密度脂蛋白结合的ITCBE；3）将透析所得的液体用1mol/L HCl调节pH值至7.0，然后缓慢逐渐滴加80μl 1mmol/L 镉离子溶液，边滴加边振荡，以免镉离子使蛋白变性沉淀；4）将加好的溶液在25℃，100r/min的摇床中反应2h，用处理好的透析袋进行透析24h；5）将透析好的液体于‑20℃分装保存，得到镉‑高密度脂蛋白螯合物的反应溶液；B）镉‑高密度脂蛋白螯合物纯化：采用免疫亲和层析法，去除步骤A）反应溶液中未反应的高密度脂蛋白、特异性抗体和镉离子，即得镉‑高密度脂蛋白螯合物；所述步骤B）中具体包括以下步骤：（1）溶解样品：将上述步骤A）的提取的镉‑高密度脂蛋白螯合物溶解于生理盐水中，得镉‑高密度脂蛋白螯合物溶液；（2）平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与高密度脂蛋白特异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；（3）上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（1）所述溶液，然后上柱，使高密度脂蛋白与填料特异性结合；（4）洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0.05‑0.10mol/L的Na2HPO4溶液进行洗脱；（5）收集：收集步骤（4）的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复原；（6）透析：将步骤（5）中的收集的洗脱液装透析袋，用ddH2O透析除盐，换水三次后，4℃透析过夜，收集样本；（7）平衡层析柱：采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能与镉特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；（8）上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（6）中样本，然后上柱；（9）洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0.5‑1.0mol/L的Na2HPO4溶液进行洗脱；（10）收集：收集步骤（9）的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复原；（11）透析：将步骤（10）的洗脱液装透析袋，用ddH2O透析除盐，换水三次后，4℃透析过夜，收集样本，即得镉‑高密度脂蛋白螯合物。