[发明专利]一种莲叶细胞次生代谢物冻干粉的制备方法及其应用

摘要

本发明公开了一种莲叶细胞次生代谢物冻干粉的制备方法及其应用，制备方法具体包括如下步骤：(1)获取莲叶细胞株：对无菌莲叶采用纤维素酶和果胶酶进行联合消化得到莲叶细胞株；(2)大量培养莲叶细胞：1)采用I号灭菌培养基进行初步培养；2)采用Ⅱ号灭菌培养基进行悬浮培养得到莲叶细胞培养物；(3)收集莲叶细胞培养物制备莲叶细胞次生代谢物冻干粉并应用于抗衰老护肤品中。本发明采用莲叶细胞培养法，通过纤维素酶和果胶酶的联合运用，最后收集培养物中的次生代谢物，不仅简化生产工艺，还提高了莲叶细胞培养效率和质量；同时产品安全性高还可长期稳定生产；运用于化妆品中具有抗衰老的作用。 1

主权项

1.一种莲叶细胞次生代谢物冻干粉的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)获取莲叶细胞株：在每0.5g‑3.0g无菌莲叶中加入5‑30ml Murashige and Skoog培养基及0.025‑0.30ml质量分数为0.2‑0.3％纤维素酶溶液和0.025‑0.30ml质量分数为0.2‑0.3％果胶酶溶液进行消化；将消化后所得消化液过滤、离心除去上清液后得到莲叶细胞株；

(2)大量培养莲叶细胞：

1)初步培养：采用I号灭菌培养基将莲叶细胞株配制成(0.5‑5)×10⁴个/ml密度的莲叶细胞液，将所述莲叶细胞液置于旋转式摇床上，在24‑27℃的环境下和转速为150‑180rpm/min的条件下培养；

2)悬浮培养：将经过初步培养后的莲叶细胞培养液去除上清液，采用Ⅱ号灭菌培养基将莲叶细胞配制成(0.5‑5)×10⁵个/ml密度的莲叶细胞液并置于发酵罐中，通入速率为0.01‑0.05m3/s的过滤空气，在24‑27℃的环境下和转速为120‑150rpm/min的条件下进行悬浮培养得到莲叶细胞培养物；

(3)制备莲叶细胞次生代谢物冻干粉：收集莲叶细胞培养物对其过滤、浓缩和冻干处理后得到莲叶细胞次生代谢物冻干粉，

其中，所述I号灭菌培养基为含有浓度为0.5mg/L的生长素2,4‑D和浓度为1.2mg/L的细胞分裂素6‑BA的MS培养基，所述Ⅱ号灭菌培养基为含有浓度为0.3mg/L的生长素2,4‑D、浓度为0.4mg/L的细胞分裂素6‑BA和浓度为1g/L的葡萄糖的MS培养基。

2.根据权利要求1所述的一种莲叶细胞次生代谢物冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤(1)中选取新鲜莲叶进行消毒。

3.根据权利要求1所述的一种莲叶细胞次生代谢物冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤(1)中将莲叶在质量分数为15％‑20％的次氯酸钠溶液中消毒，消毒后采用无菌去离子水清洗。

4.根据权利要求1所述的一种莲叶细胞次生代谢物冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述无菌莲叶在加入Murashige and Skoog培养基前为碎片，且碎片面积大小≤1mm²；所述纤维素酶溶液与果胶酶溶液体积为1:1。

5.根据权利要求1所述的一种莲叶细胞次生代谢物冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤(1)中采用200目无菌网筛对消化液进行过滤，将过滤液加入到Countstar细胞计数器中，过滤液在250g的离心力下离心10min。

6.根据权利要求1所述的一种莲叶细胞次生代谢物冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤(2)中初步培养时每100ml莲叶细胞液培养14天。

7.根据权利要求1所述的一种莲叶细胞次生代谢物冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述莲叶细胞培养物采用孔径小于0.45μM的滤膜过滤；浓缩上清液至浓缩液中蛋白浓度为50±0.5μg/ml；浓缩上清液采用孔径小于0.22μM的滤膜过滤；所述冻干处理时冻干温度为(‑20℃)‑(‑35℃)，真空度为50‑200Pa，冻干时间为24‑36小时，即得到莲叶细胞次生代谢物冻干粉。