[发明专利]一种用于区分梨品种的RAPD引物及其应用

摘要

本发明公开了一种用于区分梨品种的RAPD引物及其应用，属于分子生物学分子标记领域。该方法通过设计筛选出的3个RAPD随机引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO1～3所示，用于扩增未知品种的梨的DNA，通过统计凝胶电泳后的谱带，区分出具有唯一特异性谱带的品种，并建立被区分品种的树形鉴别图。本发明的引物提高了RAPD反应的稳定性，操作简便，高效准确，节省引物，仅通过3次PCR就可轻松的将“玉露香”等22个梨品种在分子水平上进行快速区分，所得到的品种鉴定图比聚类树更具有直观性，即根据品种鉴定图就可以快速找出能区分任意两个品种的引物，该方法可以实现梨苗木的早期鉴定，在其他物种上也具有广泛的通用性。

主权项

用于区分梨品种的RAPD引物在区分梨品种中的应用，所述用于区分梨品种的RAPD引物包括如下序列：P3：5’‑CTTGCTATGGT‑3’；P12：5’‑GCACAAGATGA‑3’；P32：5’‑GTAGGTGTCAC‑3’；所述的梨品种为：“翠冠”、“翠绿”、“中梨1号”、“翠玉”、“初夏绿”、“早冠”、“早金酥”、“金晶”、“玉绿”、“黄冠”、“玉露香”、“冀玉”、“红香酥”、“寒红”、“寒香”、“圆黄”、“西子绿”、“苏翠1号”、“苏翠2号”、“丰水”、“秋子梨”、“丰香”；包括如下步骤：(1)提取梨的基因组DNA；(2)利用P3引物对步骤(1)得到的基因组DNA进行RAPD扩增，得到的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测，若在550bp、1500bp处都出现特征性谱带，而在700bp和1000bp都无特征性谱带，梨的品种为“玉露香”；若在1500bp、1000bp、700bp处都出现特征性谱带，而550bp无特征性谱带，梨的品种为“红香酥”；若在1500bp、700bp都出现特征性谱带，而1000bp、550bp都无特征性谱带，梨的品种为“苏翠2号”；(3)若琼脂糖凝胶电泳检测结果与步骤(2)不符，则利用P12引物再对基因组DNA进行RAPD扩增，若在550bp、1000bp、1500bp都出现特征性谱带，而在700bp处未出现特征性谱带，利用引物P12扩增后，经琼脂糖凝胶电泳检测在1000bp出现特征性谱带的，其品种为“翠玉”；利用引物P12扩增后，在1000bp无特征性谱带的，其品种为“玉绿”；若在550bp、700bp、1000bp都出现特征性谱带，而在1500bp处未出现特征性谱带，利用引物P12扩增后，经琼脂糖凝胶电泳检测在1800bp、1500bp均出现特征性谱带，其品种为“寒红”；若利用引物P12扩增后，在1500bp、1000bp处都出现特征性谱带，其品种为“丰水”；若利用引物P12扩增后，仅在1000bp处出现特征性谱带，其品种为“寒香”；若在550bp、700bp都出现特征性谱带，而在1500bp、1000bp都无特征性谱带，利用引物P12扩增后，经琼脂糖凝胶电泳检测在500bp出现特征性谱带，其品种为“早金酥”；利用引物P12扩增后，若在600bp、1300bp都出现特征性谱带，其品种为“翠绿”；利用引物P12扩增后，若在600bp出现特征性谱带，而1300bp未出现特征性谱带，其品种为“金晶”；利用引物P12扩增后，若在1300bp、900bp均出现特征性谱带，而在80bp处未出现特征性谱带，其品种为“西子绿”；利用引物P12扩增后，若在1300bp、900bp、80bp均出现特征性谱带，则进入步骤(4)；若在550bp、700bp、1500bp都出现特征性谱带，而在1000bp处未出现特征性谱带，利用P12引物扩增后，经琼脂糖凝胶电泳检测仅在400bp出现特征性谱带，其品种为“初夏绿”；利用引物P12扩增后，若在600bp、100bp都出现特征性谱带的，其品种为“圆黄”；利用引物P12扩增后，若在600bp、400bp都出现特征性谱带的，其品种为“苏翠1号”；利用引物P12扩增后，若在1500bp、600bp均出现特征性谱带的，其品种为“翠冠”；利用引物P12扩增后，若在1500bp、400bp都出现特征性谱带的，其品种“秋子梨”；利用引物P12扩增后，若仅在1500bp出现特征性谱带，则进入步骤(5)；(4)利用P12引物进行RAPD扩增，若在1300bp、900bp、80bp均出现特征性谱带，再用P32引物进行RAPD扩增，若仅在1300bp出现特征性谱带的，其品种为“黄冠”；用P32引物进行RAPD扩增，若仅在1000bp出现特征性谱带的，其品种为“冀玉”；用P32引物进行RAPD扩增若在1300bp、1000bp均出现特征性谱带的，其品种为“早冠”；(5)利用P12引物进行RAPD扩增，若仅在1500bp出现特征性谱带，再用P32引物进行RAPD扩增，若在900bp出现特征性谱带的，其品种为“中梨1号”，用P32引物进行RAPD扩增，若在900bp未出现特征性谱带，其品种为“丰香”。