[发明专利]抗脂环酸芽孢杆菌单克隆抗体的制备方法

摘要

本发明涉及一种抗脂环酸芽孢杆菌单克隆抗体的制备方法，该方法包括以下步骤⑴制备免疫接种的小鼠；⑵骨髓瘤细胞培养3~4天，得到培养后的小鼠骨髓瘤细胞；⑶将脂环酸芽孢杆菌向免疫接种的小鼠腹腔接种免疫，并且获得脾细胞，经分散脾细胞得到脾细胞沉淀物；⑷培养后的小鼠骨髓瘤细胞离心得到骨髓瘤细胞沉淀物；⑸用DMEM高糖培养液分别悬浮脾细胞沉淀物、骨髓瘤细胞沉淀物并混合，经离心得到沉淀物；⑹沉淀物离心、悬浮，即得融合细胞；⑺将融合细胞进行培养、测定，确定杂交瘤细胞；该杂交瘤细胞进行克隆、筛选得到杂交瘤细胞系；⑻制备单克隆抗体将杂交瘤细胞系按常规方法进行单克隆抗体生产即得。本发明快速、特异性高。

主权项

抗脂环酸芽孢杆菌单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：⑴制备免疫接种的小鼠：取复壮后的脂环酸芽孢杆菌模式菌株ATCC 49025与等量佐剂充分混匀，分别注入小鼠颈背部两侧、腹股沟部皮下；每只每次剂量为0.2ml，首次注射含菌数量为1×108，间隔3周，同法重复注入两次，即得免疫接种的小鼠，该免疫接种的小鼠在最后一次免疫后两周进行小鼠血清中抗脂环酸芽孢杆菌抗体滴度的测定，将显示抗体滴度达到1：20000的小鼠作为免疫脾细胞的来源；其中第一次免疫用弗氏完全佐剂，第二次、第三次均采用弗氏不完全佐剂；第二次比第一次含菌数量加倍，第三次比第二次含菌数量加倍；⑵将X‑63小鼠细胞系、NS‑1小鼠细胞系、SP2/0小鼠细胞系中的一种作为骨髓瘤细胞，并将该骨髓瘤细胞在常规培养液中培养3~4天，得到培养后的小鼠骨髓瘤细胞；⑶按每只每次剂量为0.2ml、含菌数量为4×108的脂环酸芽孢杆菌向所述步骤⑴所得的免疫接种的小鼠腹腔接种免疫，并且在3~4天后取小鼠的脾脏获得脾细胞，分散脾细胞，然后按体积比1 ml：30 ml加入DMEM高糖培养液，轻轻吸打数次，再将脾细胞离心去上清液，得到脾细胞沉淀物；⑷将所述步骤⑵所得的培养后的小鼠骨髓瘤细胞离心去上清液，得到骨髓瘤细胞沉淀物；⑸用DMEM高糖培养液分别悬浮所述脾细胞沉淀物、所述骨髓瘤细胞沉淀物，并将脾细胞与骨髓瘤细胞按5~10：1的数量比混合所述脾细胞沉淀物、所述骨髓瘤细胞沉淀物，然后离心去上清液，充分分散，得到沉淀物；⑹所述沉淀物中按体积比1 ml：2 ml加入质量浓度为50%的聚乙二醇PEG1000，静置1~2分钟后离心去上清液，并缓慢加入所述沉淀物体积的25~35倍的HAT培养液进行悬浮，最后补加HAT培养液至所述沉淀物体积的140~160倍，即得融合细胞；⑺将所述步骤⑹所得的融合细胞按100μL/孔加入至96孔培养板中，且每孔中再加入100 μL浓度为1~2×105个/mL的含小鼠腹腔巨噬细胞的HAT培养液作为饲养细胞，然后将所述培养板置于体积浓度为3~7%的二氧化碳培养箱中，在温度为35~38℃条件下培养10~14小时；培养3~4天后即观察所述培养板孔中是否出现杂交细胞集落，当孔中出现杂交细胞集落后，每隔2~3天用每孔半量HAT培养液换液一次；7~9天后每孔取培养上清液100μL，分别进行抗脂环酸芽孢杆菌抗体及其抗体滴度的测定；再在原培养板每孔中补加半量HT培养液；继续在温度为37℃、5%的二氧化碳培养箱中培养；直至ELISA检测培养上清的抗脂环酸芽孢杆菌抗体阳性，且细胞上清的抗体滴度达到1：1000以上时，则确定为所需的杂交瘤细胞；将所述杂交瘤细胞转移到另一块96孔板中，采用有限稀释法进行克隆，筛选得到克隆孔均呈抗体阳性且抗体滴度稳定的杂交瘤细胞系；⑻制备单克隆抗体：将所述杂交瘤细胞系转移到细胞培养瓶中培养，然后按常规方法采用大瓶旋转培养法或同系小鼠体内诱生法进行单克隆抗体生产即得。