[发明专利]一种扣囊复膜孢酵母菌多克隆抗体及制备方法

摘要

本发明属于动物基因工程领域，具体涉及一种扣囊复膜孢酵母菌多克隆抗体及制备方法。本发明分离的扣囊复膜孢酵母菌CB蛋白的BGL1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。对扣囊复膜孢酵母菌CB蛋白抗原表位预测分析,得到含抗原表位较多的片段，构建大肠杆菌重组表达载体，用该表达载体转化大肠杆菌，得到表达CB蛋白的重组株。对重组株进行诱导表达和对CB蛋白大量表达、纯化，以纯化的CB蛋白作扣囊复膜孢酵母菌多克隆抗体的免疫原免疫动物得到多克隆抗体。本发明的多抗特异性好，纯度和效价高，保存期长，可用于遗传工程中的免疫印迹、免疫组化分析等。

主权项

一种原核表达的扣囊复膜孢酵母菌CB蛋白在制备一种抗扣囊复膜孢酵母菌β‑葡萄糖苷酶抗原的多克隆抗体中的应用，其特征在于该扣囊复膜孢酵母菌CB蛋白的序列如SEQ ID NO：4所示，该扣囊复膜孢酵母菌CB蛋白的C端带有6个组氨酸标签；通过如下步骤制备得到CB蛋白：(1)对如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的扣囊复膜孢酵母菌CB蛋白进行抗原表位的预测与分析；(2)筛选得到一段抗原表位较多的片段，该片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；(3)克隆SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，得到重组表达载体pET‑21a(+)‑BGL1；(4)将重组表达载体pET‑21a(+)‑BGL1转化大肠杆菌DH5α，构建表达CB蛋白的重组菌株；(5)对重组菌株进行诱导表达，并进行表达形式的检测；(6)用镍柱亲和层析法对扣囊复膜孢酵母菌CB蛋白进行纯化，通过抗血清制备，进一步纯化得到多克隆抗体；其中：步骤(3)构建重组载体时，克隆扣囊复膜孢酵母菌BGL1基因的插入位点为EcoRI和XhoI酶切位点；步骤(3)中，构建重组载体所用的引物序列如下所示：正向引物F：CCGGAATTCGGTGACAGATCCGGGACTGCT，反向引物R：CCGCTCGAGTCTCAAAAGCTCAAACTCAAC；步骤(5)中对重组菌株进行诱导，采用自诱导培养基诱导蛋白的表达，该自诱导培养基的成分为：酵母提取物0.5％；Na2HPO4 50mM；KH2PO4 50mM；(NH4)2SO4 25mM；MgSO4 2mM；甘油0.5％；葡萄糖0.05％；乳糖0.2％。