[发明专利]经血间充质干细胞的培养方法

摘要

本发明提供了一种制备经血间充质干细胞的方法，包括采集女性经血为原料，无菌处理经血；分离经血中的干细胞；培养经血间充质干细胞；经血间充质干细胞的冻存；经血间充质干细胞的复苏。本发明的方法具有如下技术特点：采集女性的经血，保存液于保存液中；防范细菌污染方法，从采集源头减少污染几率，用无菌水多次冲洗采集杯的，有效减少污染几率；采用差异离心方法，尽量除去经血中的细菌；通过羟乙基淀粉（HES）对样品进行重复多次分离，可获得最大量的经血间充质干细胞；使用无血清培养基培养减少动物源成分使用，细胞性能稳定，可维持经血间充质干细胞在体外长期培养过程，维持细胞形态、增殖能力、MSC表面标记表达、分化能力等。所用到的方法简单易行，操作方便，并且能最大量获得所需的干细胞并培养成功。

主权项

一种制备经血间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1）使用月亮杯采集女性经期中第二天或第三天的经血作为原料；将采集到的经血倒入装有保存液的无菌容器中，4℃保存； 2）48h内将浸泡在经血保存液中的经血运至实验室，将经血和保存液充分混匀，转移至离心管中，首次离心为800‑1000g/5‑15min，除去上清；加入清洗液，充分混匀，再次离心为300‑700g/5‑15min ，除去上清； 3）差异离心后，加入1%‑6%羟乙基淀粉，充分混匀后，静止10‑60分钟，取得经血中的经血干细胞；4）使用无血清培养基培养经血间充质干细胞，其中P0代经血间充质干细胞长满至80%密度后，使用胰酶消化，消化时间为3‑5min，P0代之后，细胞在传代操作后48‑72h内一固定时间点进行传代，要求传代时细胞密度80%‑90%以上，传代后细胞按3‑8×10³个/cm²密度接种，培养过程中注意观察培养基PH值变化，一旦变黄添加新鲜培养基并去除培养器皿中等量旧培养基，细胞从P0代传代，传至P1～P30中间的任何一代次；6）P0～P30代蜕膜间充质干细胞的冻存：每10⁶‑10⁷细胞加入1ml冻存液，放入冻存盒，转入‑80℃冰箱，12～24h后转入‑196℃液氮或气氮中保存备用。