[发明专利]草莓超低温疗法脱毒再生苗病原体检测的方法

摘要

本发明公开了一种草莓超低温疗法脱毒再生苗病原体检测的方法，具体包括如下步骤：(1)田间草莓苗提取总RNA：(2)总RNA反转录为cDNA(3)设计四种病毒引物；(4)单一RT-PCR检测田间苗；(5)多重RT-PCR病毒检测体系：本发明在利用单一RT-PCR检测SVBV、SMYEV、SMoV和SCV的基础上，通过优化影响多重RT-PCR的因子，建立起多重RT-PCR检测SVBV、SMYEV、SMoV和SCV四种常见草莓病毒的技术体系。

主权项

草莓超低温疗法脱毒再生苗病原体检测的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：(1)田间苗提取总RNA：采用改良3％CTAB法提取草莓叶片总RNA；(2)总RNA反转录为cDNA：以提取的总RNA逆转录产物为模板，内参引物对为295bp大小，进行常规PCR反应；(3)设计四种病毒引物；(4)单一RT‑PCR检测田间苗：取逆转录产物cDNA 1μl进行单一PCR反应，检测试验材料草莓中是否含有四种常见草莓病毒，PCR体系中所加的引物为筛选的合适引物，浓度为0.2μmol·L‑1，体系中还包括：TaqMix 10ml，用超纯水补充至20μl，整个操作必须在冰上进行；PCR反应程序为：94℃，3min；94℃，1min；退火温度，40s；72℃，40s，35个循环；最后72℃延伸5min，用2.0％的琼脂糖凝胶电泳EB染色检测扩增产物；(5)多重RT‑PCR病毒检测体系：根据已筛选出的适合多重RT‑PCR反应的引物，通过对PCR体系的不断优化，寻找出适合多重引物的最优PCR条件，多重PCR体系中，引物浓度为0.1～0.5μmol·L‑1，20mmol·L‑1MgCl2浓度为1.6～2.4μl，10×PCR Buffer 2μl，dNTPs 0.2μl，Taq酶0.4μl，最后用超纯水补足至20μl，PCR反应的退火温度为52℃～58℃，退火时间为40s，延伸温度68℃～72℃和延伸时间40s～2.0min在多重PCR中被试验，用2.0％的琼脂糖凝胶电泳EB染色检测扩增产物。