[发明专利]一种环二肽的生产方法

摘要

本发明涉及一种环二肽的生产方法，属于天然化合物合成技术。采用冷却变温合成及高压高温水相环化技术制备环(组氨酸-脯氨酸)二肽。以组氨酸脯氨酸二肽甲酯的盐酸盐为原料，在含强碱弱酸性盐的水中采用高压高温辅助法合成高品质、高纯度的组氨酸-脯氨酸环二肽，与传统的甲醇回流法相比，省时、高效，产品得率高，无消旋现象发生。

主权项

一种环二肽的生产方法，其特征在于包括下列步骤：(一)低温保护氨基酸氨基以L‑组氨酸为原料，将其溶于水‑四氢呋喃(v/v＝1:2)溶剂中，L‑组氨酸的浓度为0.25～0.50mol/L，以二碳酸二叔丁酯[(Boc)₂O]为保护剂进行氨基保护，首先配制四氢呋喃‑(Boc)₂O溶液，其中(Boc)₂O浓度为1～1.5mol/L，加到含L‑组氨酸的pH8～9的碱水溶液中，His︰(Boc)₂O(mol/mol)＝1:(2～2.5)，‑5℃～‑10℃下搅拌反应15～30min，搅拌速率80～100r/min，然后升温至30℃～40℃搅拌反应4～6h，反应结束后于温度38℃、真空度为‑0.1MPa条件下减压脱除有机溶剂，剩余物1:(18～20)(g/mL)比例加水溶解，用乙醚洗涤2～3次，每次洗涤时水相：乙醚相(v/v)＝2：1，脱除残留的(Boc)₂O，然后于0℃条件下用质量浓度为50％的柠檬酸溶液调酸至pH3～4，得到游离的N^im‑Boc‑N^α‑Boc‑L‑组氨酸，最后用乙酸乙酯萃取3～4次，每次萃取时水相/乙酸乙酯相(v/v)＝1︰1，萃取氨基被保护的后L‑组氨酸，然后再于温度35℃、真空度为‑0.1MPa条件下减压蒸干脱除乙酸乙酯，得到氨基已被保护的L‑组氨酸，此过程将L‑组氨酸的N‑端氨基和侧链咪唑基用叔丁氧羰基(Boc‑)保护，生成N^im‑Boc‑N^α‑Boc‑L‑组氨酸；(二)低温保护氨基酸羧基将L‑脯氨酸悬浮于无水甲醇中，L‑脯氨酸在无水甲醇中浓度为0.2～0.5mol/L，冷却到0℃，向体系中通入干燥HCl气体，通气搅拌反应2～3h，搅拌速率为80～100r/min，反应结束后于温度35℃、真空度为‑0.1MPa条件下减压蒸发除去甲醇和过量的HCl，得到C‑端羧基被保护的L‑脯氨酸甲酯盐酸盐；(三)形成肽键以二氯甲烷(DCM)为溶剂，将经过(一)、(二)制备的N(im)‑叔丁氧羰基‑N(α)‑叔丁氧羰基‑L‑组氨酸(N^im‑Boc‑N^α‑Boc‑L‑His)溶于DCM，调整N^im‑Boc‑N^α‑Boc‑L‑His在DCM中浓度为0.03～0.06mol/L的溶液，然后加入1‑羟基苯并三氮唑HOBt制成混合液，将N'N‑二环己基碳二亚胺DCC用DCM进行溶解，配制成DCC浓度为0.3～0.5mol/L的溶液，然后于‑5℃～‑10℃条件下将该溶液滴加到上述混合液中，搅拌反应20～30min，搅拌速率为80～100r/min，建立肽键形成反应体系，用等质量的三乙胺中和脯氨酸甲酯盐酸盐(Pro‑OMe·HCl)，然后用定量滤纸过滤，滤液加入到上述肽键形成反应体系中，最后加入少量的三乙胺调整反应体系pH7～8后，然后升温至35～40℃，以80～100r/min速率继续搅拌反应2～4h，反应底物配比为：(N^im‑Boc‑N^α‑Boc‑L‑His)︰(Pro‑OMe·HCl)︰DCC︰HOBt(mol/mol)＝1︰(1.4～2.0)︰(1.4～2.0)︰(1.4～2.0)，反应结束后溶液用定量滤纸过滤，以除去副产物N,N’‑二环己基脲(DCU)，然后于温度26～30℃、真空度为‑0.1MPa条件下减压浓缩，得到的浓缩物用乙酸乙酯溶解溶解，浓缩物︰乙酸乙酯(g/mL)＝1:(25～30)，过滤脱除残余DCU，滤液依次用饱和NaCl溶液、饱和NaHCO₃溶液洗涤2～5次，每次乙酸乙酯相︰饱和NaCl或饱和NaHCO₃溶液(v/v)＝3︰(1～2)，最后用饱和NaCl洗至中性，除去剩余的DCU以及HOBt，然后采用硅胶柱层析纯化，硅胶柱填料为粒度200～300目硅胶，洗脱剂为石油醚︰乙酸乙酯(v/v)＝8︰(2～3)，得到精制的N(im)‑叔丁氧羰基‑N(α)‑叔丁氧羰基‑L‑组氨酸‑L‑脯氨酸甲酯(N^im‑Boc‑N^α‑Boc‑L‑His‑Pro‑OMe)；(四)氨基酸被保护氨基与羧基的选择性脱除称取(三)制备的N^im‑Boc‑N^α‑Boc‑L‑His‑Pro‑OMe溶于乙酸乙酯中，调整N^im‑Boc‑N^α‑Boc‑L‑His‑Pro‑OMe浓度为0.1～0.3mol/L，于0℃条件下通入干燥的HCl气体，搅拌反应30～45min，搅拌速率80～100r/min，反应结束后于温度35℃、真空度为‑0.1MPa条件下减压蒸脱溶剂，脱除Boc‑保护基，得到保留C‑端保护基的L‑组氨酸‑L‑脯氨酸甲酯的盐酸盐；(五)高温高压水相环化制备环二肽将L‑组氨酸‑L‑脯氨酸甲酯盐酸盐(L‑His‑L‑Pro‑OMe·2HCl)悬浮于水中，配制成L‑His‑L‑Pro‑OMe·2HCl浓度为0.01～0.05mol/L的悬浮液，用NaHCO₃中和至pH6.0，释放游离的L‑组氨酸‑L‑脯氨酸甲酯，然后将溶液密封，在温度130℃～136℃、压力0.17～0.23MPa条件下进行环化反应2.5～3h。反应结束后溶液用定量滤纸过滤，滤液于温度45～50℃、真空度为‑0.1MPa条件下减压浓缩，得到产物采用硅胶柱层析纯化，层析柱填料为粒度200～300目硅胶，洗脱剂甲醇︰氯仿(v/v)＝1︰(4～5)，最终得到环(组氨酸‑脯氨酸)二肽淡黄色固体。