[发明专利]一种重组褐藻胶裂合酶的制备方法

摘要

本发明属于生物技术领域，涉及一种重组褐藻胶裂合酶的制备方法。本发明将重组大肠杆菌在发酵罐中进行培养，加入诱导剂诱导产酶；离心收集菌体，超声破碎后离心，收集上清液，利用亲和层析得到纯度95%的褐藻胶裂合酶，回收率达到70%以上。本发明的制备方法适用于中试和产业化生产褐藻胶裂合酶，具有工艺简单、容易控制、纯化效果好、回收率高、成本低的优点。

主权项

一种重组褐藻胶裂合酶的制备方法，其特征在于，该方法包括：（1）将保存在‑80℃的大肠杆菌BL21(DE3)/pET24‑algL在LB平板上划线，30‑37℃培养过夜；（2）挑取单克隆至LB培养液中，30‑37℃ 100‑300 r/min振荡培养至OD₆₀₀=0.5‑2.0，根据发酵罐体积决定种子液体积和转接次数；（3）按照1‑10% (v/v)的接种量接种到发酵罐中，发酵罐中装入LB培养基，装液量为50‑80%，初始通气为1 vvm，初始搅拌转速为350 r/min，温度控制为30‑40 ℃，pH控制在6.0‑8.0，通过调节通气量和转速控制溶氧在15‑40%；当菌体长至OD₆₀₀=0.5‑5.0时，加入终浓度为0.1‑1.0 mM的IPTG，在15‑20℃诱导24‑72 h；（4）将发酵液离心，收集菌体，重悬于含有500 mM NaCl的50 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.6）；利用超声完全破碎细菌，离心，收集上清液；上清液上样于镍离子亲和层析柱，用咪唑梯度洗脱，收集洗脱组分，根据酶活测定结果合并活性组分；活性组分对50 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.6）进行透析过夜，分装后储存在‑20℃。