[发明专利]一种原花青素诱导肝癌细胞自噬性死亡的分析方法及应用

摘要

本发明公开了一种原花青素诱导肝癌细胞自噬性死亡的分析方法及应用，本发明采用人肝癌HepG2细胞进行实验，测定原花青素对HepG2细胞增殖的影响，诱导HepG2细胞自噬死亡的剂量效应和时间效应，细胞内ROS(reactive oxygen species，高活性氧自由基)含量，细胞周期分布，线粒体膜电位测定。结果证实，原花青素能通过刺激ROS途径诱导人肝癌HepG2细胞自噬性死亡，并将这一成果应用到预防和治疗肝癌之中。

主权项

一种原花青素诱导肝癌细胞自噬性死亡的分析方法，其特征在于：包括，原花青素对肝癌HepG2生长增殖的抑制作用的分析：取对数生长期的HepG2细胞经胰蛋白酶消化，接种培养24h后，经原花青素处理6～120h，除去培养基并洗涤后，加入MTT孵育，结束后加入DMSO溶解，于酶标仪490nm处测定吸光度，计算生长抑制率；CSPCs诱导HepG2细胞自噬的剂量效应和时间效应的分析：标记自噬细胞，将HepG2细胞接种培养孵育24h后，用原花青素处理细胞不同时间或用雷帕霉素处理12h，实验结束后孵育1h后，于倒置荧光显微镜下观察并荧光定量；透射电镜观察自噬小体的分析：收集各处理组的HepG2细胞，离心，弃上清，分别固定，然后脱水，超薄切片，乙酸双氧铀和柠檬铅负染，于透射电镜观察并定量；细胞的周期分析：取对数生长期HepG2细胞接种孵育24h后，用原花青素处理细胞12h，或经预处理后用原花青素孵育，实验结束后，加入碘化丙锭染色液避光染色，过滤后上流式细胞仪分析细胞DNA含量的变化；细胞内高活性氧自由基分析：细胞内高活性氧自由基含量采用氧化敏感探针，DCFH‑DA进入细胞被高活性氧自由基氧化成有荧光2'7'‑dichlorofluorescein，通过测定DCF荧光强度即能反映高活性氧自由基产生的量，将细胞分别用原花青素和阳性对照雷帕霉素孵育，随后用原花青素孵育，细胞经DCFH‑DA处理后，立即于荧光显微镜观察并定量；线粒体膜电位测定的分析：线粒体膜电位测定采用亲脂性荧光探针JC‑1，在正常细胞内JC‑1以聚合体的形式分布在线粒体内，在590nm处会激发出红色荧光，表明高的膜电位，当线粒体膜电位下降，JC‑1以单体形式与膜结合，在530nm处激发出绿色荧光，因此通过JC‑1的红光/绿光强度比可以判断线粒体膜电位的变化，将HepG2细胞经原花青素处理12h，收获细胞，洗涤，用含有JC‑1的完全培养基于37℃孵育30min，直接于荧光显微镜下观察并分析；数据处理分析：数据以X±SD表示，采用SPSS统计学软件，进行t检验数据处理和方差分析，其中，—X代表平均值，SD代表标准偏差，t代表检验某个变量的总体均值和某指定值之间是否存在显著性差异。