[发明专利]一种粗榧生物碱的工业化生产方法

摘要

本发明属于植物内生菌分离与微生物发酵工程领域，具体涉及一种粗榧生物碱的工业化生产方法。通过选取多年生粗榧的根、茎、叶作为外植体，经切条、灭菌后放入培养基中培养使其长出粗榧共生菌，然后对粗榧共生菌按照菌种不同进行分离并分别培养发酵，将发酵液浓缩后筛选以获得可代谢粗榧生物碱的菌种，并进行发酵培养，从培养产物中分离出发酵液，经醇降、抽滤和干燥即制得粗榧生物碱。本发明通过将活化后的菌种先接种到装有发酵培养基的摇瓶内培养,然后再进行四级种子罐扩大培养，使得菌种生理状况稳定，活力强，移种后能够迅速生长，在短时间内获得大量高品质的菌种，缩短了发酵时间，提高了生产效率。

主权项

一种粗榧生物碱的工业化生产方法，选取多年生粗榧的根、茎、叶作为外植体，经切条、灭菌后放入培养基中培养使其长出粗榧共生菌，然后对粗榧共生菌按照菌种不同进行分离并分别培养发酵，将发酵液浓缩后筛选以获得可代谢粗榧生物碱的菌种，并进行发酵培养，从培养产物中分离出发酵液，经醇降、抽滤和干燥即制得粗榧生物碱，其特征在于：所述粗榧共生菌分别培养发酵的具体操作方法为将粗榧共生菌活化后放入温度为26℃的环境中培养48h，根据不同菌种的菌落特征鉴定出各菌种，再将各菌种分别接种到装有PDA培养基的培养皿上培养，待菌种代谢产生代谢物1‑2天后接入第二批菌种，以促进第二批菌种的生长，第二批接种的菌种长出后接种到装有发酵培养基的摇瓶内，然后把摇瓶放入转速为200r/min、温度为28℃的摇床上培养5d，收集各菌种的发酵液即可；其中，所述发酵液浓缩的具体操作方法为将各菌种的发酵液分别放入转速为10000r/min的冷冻高速离心机中离心，收集上清液，把上清液放入转速为10000r/min的冷冻高速离心机中再次离心，然后把再次离心后的上清液放入温度为40‑50℃、压强为0.05Mpa的旋转蒸发仪中浓缩至原体积的十分之一，再将各菌种的浓缩液分别放入温度为4℃的冰箱内即可；所述发酵培养的具体操作方法为将筛选出的可代谢粗榧生物碱的菌种活化，之后接种到装有发酵培养基的摇瓶内培养5d，然后放入发酵种子罐中经四级发酵即可；所述醇降、抽滤的具体操作方法为将分离的发酵液在温度为40‑50℃下打入真空浓缩罐内浓缩至原体积的二十分之一，再把浓缩液打入装有体积浓度为95%的乙醇醇降罐内醇降24h，且浓缩液与乙醇的体积比为1:10，制得醇降产物，将醇降产物注入抽滤缸内抽滤，制得结晶产物，然后将结晶产物打入装有体积浓度为95%的乙醇醇降罐内重复上述醇降、抽滤过程2‑3次后收集结晶产物即可；所述摇瓶内发酵培养基由土豆汁、葡萄糖、蛋白胨、可溶性淀粉、MgSO4、KH2PO4和水制成，且各组分的质量百分比为土豆汁2%，葡萄糖2%，蛋白胨0.12%，可溶性淀粉1%， MgSO4 0.05%， KH2PO4 0.15%，余量为水，培养基的pH=7；所述土豆汁由组分A和组分B按照10:1的重量比混合后放入旋转蒸发仪中浓缩至原体积的三分之一后制得，所述组分A是将土豆切碎后放入温度为95‑100℃的锅中蒸煮20‑30min，取出后过100‑200目筛，收集滤液制得；所述组分B是将土豆切碎后放入榨汁机中压榨，再把榨汁过80‑100目筛，收集滤液制得。