[发明专利]人脂肪干细胞的获取方法及多级同种异体脂肪干细胞库的构建方法

摘要

人脂肪干细胞的获取方法及多级同种异体脂肪干细胞库的构建方法，涉及一种脂肪干细胞的获取方法及脂肪干细胞库的构建方法。为了解决现有人脂肪干细胞的获取方法，脂肪采集方法对细胞活性破坏大及现有脂肪干细胞库中干细胞多次传代后给多人使用容易出现干细胞老化现象的问题。干细胞获取方法：一、供者的筛选；二、脂肪采集；三、脂肪的运输；四、人脂肪干细胞的分离。干细胞库的构建方法：一、供者的筛选；二、脂肪采集；三、脂肪的运输；四、人脂肪干细胞的分离；五、脂肪干细胞培养、传代、扩增；六、主细胞库建立；七、工作细胞库建立。本发明方法对细胞活性破坏较小，并建立了多人份异体使用的多级干细胞库，用于脂肪干细胞库的建立。

主权项

人脂肪干细胞的获取方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：一、供者的筛选：供者要求身体健康，供者血液中HCV、HBsAg、HBcAb、CMV、HIV、Syphilis、HLTV和EBV病毒检测为阴性，血液中厌氧菌、需氧菌、广谱支原体和真菌检测均为阴性，排除有既往病史、有家族遗传病史、有吸毒史、无炎症、无伤口愈合困难和依从性差的患者，若供体为女性则要求其处于非孕期和非生理期状态，供者对麻醉药无过敏反应；二、脂肪采集：对步骤一筛选后的供者进行脂肪采集，脂肪采集采用负压强度为200‑350mmHg的水动力吸脂技术，供者局部麻醉后，在腹部或者大腿切1‑2mm刀口，注入50‑400mL膨胀液，并在水动力的推动下，进行低负压吸脂，吸取的脂肪直接收集到带有筛分网的无菌接收器中，脂肪组织在接收器中停留5分钟，大部分膨胀液和筛分后的脂肪根据其比重不同自然分离，采用50mL带帽Luer Lock注射器将获得的0.1‑1mm直径的脂肪组织微球吸入注射器中；三、脂肪的运输：将步骤二采集到的脂肪组织采用多功能脂肪采集、运输试剂盒进行运输，或者将上述已吸入脂肪的50mL无菌Luer Lock注射器去掉针头，用注射器帽将注射器密封后进行直接运送；四、人脂肪干细胞的分离：在生物安全柜中，将脂肪组织分装在50mL离心管中，于1000‑1500r/min离心10min，用移液管吸取离心后的中间层脂肪组织转移于新的离心管中，加入等体积无菌生理盐水或PBS清洗，再于1000‑2000rpm离心10min，吸取清洗后的上层脂肪置于新离心管中，加入质量百分浓度为0.03％‑0.06％的I型胶原酶，混匀盖好盖，于37℃培养箱中震荡消化15‑30min，然后加入PBS或者生理盐水，并吹打组织，将细胞悬液经过75μm孔径细胞滤器过滤，得到单细胞悬液，于1000‑2000rpm离心10min，获得细胞沉淀，加入生理盐水或PBS重新洗涤细胞一次，离心，沉淀即为人脂肪干细胞。