[发明专利]转Bt基因抗虫水稻对捕食性天敌青翅蚁形隐翅甲安全性评价方法

摘要

本发明涉及一种转Bt基因抗虫水稻对捕食性天敌青翅蚁形隐翅甲安全性评价方法,由三级营养试验，蛋白传递规律，Tier-1毒性测定试验3个部分组成。各部分分别评价转Bt基因抗虫水稻通过猎物介导对青翅蚁形隐翅甲的影响；评价青翅蚁形隐翅甲暴露于Bt蛋白的途径和程度；评价转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白对青翅蚁形隐翅甲的潜在毒性。最终，根据3个方面的数据综合评价所述转Bt基因抗虫水稻对该非靶标生物产生的生态后果。本发明建立了一套系统、科学的评价方法，对完善转Bt基因作物对非靶标生物的影响研究以及确定转Bt基因作物种植的生态安全性具有重要意义。

主权项

转Bt基因抗虫水稻对捕食性天敌青翅蚁形隐翅甲安全性评价方法，其特征在于包括如下三个部分：(1)三级营养试验：通过水稻—褐飞虱—青翅蚁形隐翅甲的食物链评价转Bt基因抗虫水稻通过猎物介导对青翅蚁形隐翅甲的安全性影响；转基因组：取24h内孵化的青翅蚁形隐翅甲一龄幼虫，单头接入底部吸水海绵保湿的指形管内，置于温度28℃，光周期L:D＝12:12h，相对湿度65％‑80％的智能人工气候箱内培养，每管每天饲喂2‑3龄转Bt基因抗虫水稻品系上饲养的褐飞虱9‑10头，并在青翅蚁形隐翅甲幼虫一龄第二天，二龄第二天每管每头补充一头果蝇成虫；对照组，水稻品系为非转基因水稻品系，其它同转基因组；每组在指形管内各接青翅蚁形隐翅甲幼虫80头，每天上午观察记录青翅蚁形隐翅甲幼虫的存活和蜕皮情况，直至幼虫羽化，初羽化成虫24h内用万分之一电子天平称重；羽化24h后的青翅蚁形隐翅甲成虫雌雄配对，饲养于底部铺有湿润滤纸和湿润棉花的塑料培养皿内，每皿一对，每天每塑料培养皿饲喂相应水稻品系上的褐飞虱15头，每天上午观察记录青翅蚁形隐翅甲成虫所产卵粒数，测定65d；将卵粒用毛笔挑入内置湿润棉球的24孔细胞培养板内，每孔一粒卵，每天上午观察记录青翅蚁形隐翅甲卵的孵化数目；选择青翅蚁形隐翅甲的幼虫发育历期、幼虫存活率、雌性率以及初羽化体重、青翅蚁形隐翅甲成虫产卵前期、产卵量、卵孵化率作为评价参数指标，并进行统计分析，评价由褐飞虱若虫介导的转Bt基因抗虫水稻对青翅蚁形隐翅甲的安全性影响；(2)蛋白传递规律：通过ELISA检测手段鉴定青翅蚁形隐翅甲暴露于转Bt基因抗虫水稻所表达Bt蛋白的途径和程度；于2000ml玻璃罐中分别放入15日龄转基因水稻品系和非转基因水稻品系的稻苗，接入对应材料饲养的褐飞虱1龄若虫，待褐飞虱2‑3龄时分别取水稻叶鞘和褐飞虱若虫；水稻叶鞘组织取样30±1mg，褐飞虱若虫取样35±1mg；每组处理重复3次；以不同组的稻苗饲养的2‑3龄褐飞虱若虫饲养青翅蚁形隐翅甲幼虫直至羽化，对24h内的初羽化青翅蚁形隐翅甲成虫取样35±2mg，每组处理重复3次；采用ELISA技术，分别对以上转基因水稻品系样品中Bt蛋白的含量进行检测，确定通过食物链青翅蚁形隐翅甲暴露于转Bt基因抗虫水稻所表达Bt蛋白的程度；(3)Tier‑1毒性测定试验：评价转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白对非靶标生物青翅蚁形隐翅甲的潜在毒性；用塑料培养皿饲养48h内孵化的青翅蚁形隐翅甲一龄幼虫，培养皿底部放置厚度1±0.5cm的湿润基质土壤；用三种形式的人工饲料搭配非转基因水稻品系上饲养的1‑2龄褐飞虱若虫为青翅蚁形隐翅甲幼虫的饲料，三种形式的饲料为：人工饲料、人工饲料与褐飞虱、添加转Bt基因抗虫水稻叶鞘组织Bt蛋白表达量的10倍以上剂量的饲料及褐飞虱与含有1mg/g砷酸二氢钾的人工饲料；每个培养皿接青翅蚁形隐翅甲幼虫1头，每个处理共75头，每日更换饲料并观察记录青翅蚁形隐翅甲蜕皮及存活情况，直至羽化，初羽化成虫在24h内用万分之一电子天平称重；添加褐飞虱是在青翅蚁形隐翅甲幼虫取食人工饲料第6、7、8三天补充；所述人工饲料是伊威全机能肝粉与蜂蜜的混合物；试验中通过ELISA和敏感昆虫生测技术全程监测Bt蛋白的浓度、稳定性以及生物活性；选择青翅蚁形隐翅甲的幼虫发育历期、幼虫存活率、雌性率以及初羽化体重作为评价参数指标，对其进行统计分析，以评价转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白对青翅蚁形隐翅甲的毒性影响；最终，根据三个方面的研究数据综合分析转Bt基因抗虫水稻的种植对该非靶标生物产生的生态后果。