[发明专利]一种利用免疫亲和技术提纯硫酸软骨素的方法

摘要

本发明公开了一种利用免疫亲和技术提纯硫酸软骨素的方法，属于生物医药技术领域，以解决现有技术中醇沉法提纯硫酸软骨素纯度低的问题。本发明包括以下步骤1）将硫酸软骨素作为免疫原免疫小鼠，制备抗硫酸软骨素单克隆抗体；2）抗硫酸软骨素单克隆抗体与固相载体偶联后作为免疫亲和柱填料，制备硫酸软骨素免疫亲和柱；3）通过硫酸软骨素免疫亲和柱纯化硫酸软骨素。本发明筛选出的用于捕获硫酸软骨素的抗体具高特异性，对样品中的硫酸软骨素具有极强的滞留和浓缩能力，偶联了该抗体的亲和层析介质分离纯化出的硫酸软骨素样品具有纯度高、品质好、环保节能、生产周期短等优点，适合规模化生产，易于推广。

主权项

一种利用免疫亲和技术提纯硫酸软骨素的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）将硫酸软骨素作为免疫原免疫小鼠，制备抗硫酸软骨素单克隆抗体；a.小鼠皮下注射硫酸软骨素，使小鼠产生免疫应答；b.分离步骤a产生抗体反应的小鼠脾脏中的脾细胞，所述脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞按1:3~10的比例进行细胞融合；c.将步骤b所得的融合的杂交瘤细胞用HAT培养基筛选，得到融合成功的杂交瘤细胞；d.对步骤c中所得到的融合成功的杂交瘤细胞进行ELISA检测，筛选出针对硫酸软骨素的特异性阳性杂交瘤细胞；e.将步骤d所获得的阳性杂交瘤细胞进行大罐培养或注射小鼠，取培养上清或采集腹水，以硫酸铵沉淀法和protein A/G纯化，提取特异性的抗硫酸软骨素单克隆抗体；2）所述抗硫酸软骨素单克隆抗体与固相载体偶联后作为免疫亲和柱填料，制备硫酸软骨素免疫亲和柱；所述的固相载体为琼脂糖珠，所述琼脂糖珠为经过溴化氰活化的琼脂糖珠；所述步骤2）包括：f.将活化的琼脂糖珠以PBS溶液悬浮分散，以PBS溶液稀释所述抗硫酸软骨素单克隆抗体，将所述抗硫酸软骨素单克隆抗体的PBS溶液加至琼脂糖珠的PBS溶液中，室温搅拌0.3~3小时，偶联得到偶联复合物，离心并以PBS溶液洗涤，以除去未结合的抗体；所述的PBS溶液浓度为0.1 mol/L；g.采用含有0.2~0.8 mol/L NaCl的pH为8.0的 Tris‑HCl缓冲液浸泡所述偶联复合物2小时，以封闭所述偶联复合物中多余的活性基团；然后用5~12倍于所述偶联复合物体积的所述Tris‑HCl缓冲液洗涤；h.使用上述偶联复合物装柱；3）通过所述硫酸软骨素免疫亲和柱纯化硫酸软骨素，具体地，将过滤后的硫酸软骨素粗提物溶液加至所述硫酸软骨素免疫亲和柱，使其自然滴下；过完柱后以0.1 mol/L 的PBS溶液洗柱以除去未与所述偶联复合物装柱结合的物质；最后采用体积分数为70%乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液，干燥得提纯后的硫酸软骨素。