[发明专利]一种生物转化联产D-精氨酸和胍基丁胺的方法

摘要

一种生物法联产D-精氨酸和胍基丁胺的方法，根据所设计的引物合成精氨酸消旋酶基因argR，构建表达载体pET24a-argR转入大肠杆菌株中，获得精氨酸消旋酶的基因工程菌；将PCR扩增出的speA基因片段构建表达载体pET24a-speA转入大肠杆菌，获得L-精氨酸脱羧酶基因工程菌；将含有L-精氨酸、表达精氨酸消旋酶的基因工程菌湿菌体的转化体系，搅拌反应后得到L-精氨酸和D-精氨酸的混旋物；除去精氨酸消旋酶后，补加表达L-精氨酸脱羧酶的湿菌体继续反应，至L-精氨酸完全被消耗完毕；最后分离纯化反应体系中D-精氨酸和胍基丁胺；本发明的催化酶活性高，分离纯化简单，原料便宜，总的生产成本低，且具有高的转化率，可以大规模生产，适合工业应用。

主权项

一种生物法联产D‑精氨酸和胍基丁胺的方法，其特征在于：其生产方法包括以下步骤：步骤一、制备表达精氨酸消旋酶的基因工程菌（1）、液体培养恶臭假单胞菌KT2440菌株，抽提其基因组DNA，备用；（2）、根据全球公共序列数据库Genebank中记载的登录号为AE015451.1的恶臭假单胞菌KT2440的DNA片段基因序列设计引物，所设计的引物序列如下：F‑argR‑NdeI：GGGCGGCCATATGCCCTTTCGCCGTACCCTTCTGG；R‑argR‑BamHI：CATGGATCCTCAGTCGACGAGTATCTTCGG；根据所设计的引物用高保真KOD聚合酶进行PCR扩增，将PCR产物进行电泳检测，回收，得到精氨酸消旋酶基因argR； （3）、将精氨酸消旋酶基因argR用NdeI和BamHI双酶切，纯化备用；（4）、抽提大肠杆菌表达载体pET24a，用NdeI和BamHI双酶切，与上步纯化的argR片段连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；挑取阳性转化子并测序鉴定后，抽提质粒获得argR表达载体pET24a‑argR；将表达载体pET24a‑ argR转入大肠杆菌BL21（DE3）菌株中，获得可以诱导表达精氨酸消旋酶的基因工程菌；步骤二、制备表达L‑精氨酸脱羧酶的基因工程菌（1）、液体培养大肠杆菌W3110菌株，抽提其基因组DNA，备用；（2）、根据全球公共序列数据库Genebank中记载的登录号为_007779的大肠杆菌W3110基因组的speA基因序列设计引物，引物两端添加了NdeI和HindIII酶切位点序列；所设计的引物序列如下：F‑argR‑NdeI：GTCTGTCATATGTCTGACGACATGTCTATG R‑argR‑BamHI：    GCCAAGCTTACTCATCTTCAAGATAAG采用以上述引物进行PCR扩增，得到speA基因片段，并用NdeI和HindIII酶切，回收备用；（3）、抽提大肠杆菌表达载体pET24a，用NdeI和BamHI双酶切，与上步纯化的speA基因片段连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；挑取阳性转化子并测序鉴定后，抽提质粒获得speA基因表达载体pET24a‑speA；将表达载体pET24a‑ speA转入大肠杆菌BL21（DE3）菌株中，获得可以诱导表达L‑精氨酸脱羧酶的基因工程菌；步骤三、表达精氨酸消旋酶的基因工程菌和表达L‑精氨酸脱羧酶的基因工程菌的培养挑取表达精氨酸消旋酶的基因工程菌和表达L‑精氨酸脱羧酶的基因工程菌单菌落，分别接种于LB培养基，置于37℃过夜培养；将所培养的菌转接于TB培养基，接种量为TB培养基体积的2%，然后在37℃培养4‑6小时，加入异丙基‑β‑D‑硫代吡喃半乳糖苷至终浓度0.2mmol/L，37℃继续培养18‑21小时，发酵结束，分别离心收集表达精氨酸消旋酶的基因工程菌和表达L‑精氨酸脱羧酶的基因工程菌，备用；步骤四、以L‑精氨酸为原料，转化生产α‑酮戊二酸（1）、每升转化体系中含有10‑15 g L‑精氨酸、总质量10‑15%的表达精氨酸消旋酶的基因工程菌湿菌体，余量为水，pH值调为7.0‑9.0；将反应体系水浴保持在40‑50℃，搅拌反应12‑24小时，将L‑精氨酸消旋为L‑精氨酸和D‑精氨酸的混旋物后，停止反应；（2）、除去精氨酸消旋酶，补加反应体系质量10‑15%的表达L‑精氨酸脱羧酶的湿菌体，调pH至7.0‑9.0，继续水浴保持反应体系在40‑50℃，搅拌反应12‑24小时，至高效液相色谱法检测L‑精氨酸完全被消耗完毕，停止反应；步骤五、D‑精氨酸和胍基丁胺的分离纯化反应体系反应结束后，将反应液中转化出的D‑精氨酸和胍基丁胺进行分离纯化得到D‑精氨酸和胍基丁胺。