[发明专利]一种高尔基体蛋白73(GP73)抗原硅基磁珠结合物的制备及应用

摘要

本发明提供了一种GP73抗原硅基磁珠结合物，并以此结合物作为组份之一，搭配其他组份组成了一种竞争法GP73定量检测试剂盒。本发明的试剂盒由高尔基体蛋白73(GP73)抗原硅基磁珠结合物工作液、高尔基体蛋白73(GP73)校准品、碱性磷酸酶标记抗高尔基体蛋白73(GP73)单克隆抗体工作液、清洗液和化学发光底物组成。同时本发明提供了上述GP73抗原硅基磁珠结合物的制备方法以及试剂盒各组份的制备方法，包括GP73抗原硅基磁珠结合物工作液的配制、酶标记抗体、校准品配制、清洗液、发光底物配制等步骤。本发明的试剂盒主要可应用于原发性肝癌的诊断，具有灵敏度高、线性范围宽、无hook效应、成本低检验耗时短等优点。

主权项

一种高尔基体蛋白73(GP73)抗原硅基磁珠结合物及其制备方法，其特征在于此结合物通过硅基磁珠和高尔基体蛋白73(GP73)全长抗原制备而成，其制备包括以下步骤：1)称取一定量的硅基磁珠，将硅基磁珠溶于其质量(单位：毫克)数一半毫升数的70％乙醇中，加入硅基磁珠质量(单位：毫克)数0.5％毫升数的氨水、加入3‑氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)使其终浓度为15％(V/V)，室温搅拌反应17～18小时，之后用磁板沉淀磁珠，去除上清，用纯化水清洗5次，得到表面修饰有一定量氨基的硅基磁珠；2)将上一步得到的表面修饰有氨基的硅基磁珠溶于其质量(单位：毫克)数一半毫升数的pH＝8.0±0.05的50mM Tris缓冲液中，加入戊二醛使其浓度为5％(V/V)，室温震荡反应1小时，之后用磁板沉淀磁珠，去除上清，用纯化水清洗5次，得到表面修饰有一定醛基的硅基磁珠；3)将上一步得到的表面修饰有一定醛基的硅基磁珠用pH＝7.8±0.05的50mM PBS缓冲液清洗3次后，用磁板沉淀磁珠去上清后待用；4)按每400mg硅基磁珠对应1mg高尔基体蛋白73(GP73)全长抗原的比例，称取所需量的GP73全长抗原，溶解于pH＝7.8±0.05的50mM PBS缓冲液制备出浓度为35μg/ml的高尔基体蛋白73(GP73)全长抗原溶液，待用；5)将步骤3)得到的全部表面修饰有醛基的硅基磁珠加入步骤4)的GP73全长抗原溶液中，室温震荡混匀3小时，之后用磁板沉淀磁珠，去除上清，继续用pH＝7.8±0.05的50mM PBS缓冲液清洗至上清OD280＜0.0050。再次用磁板沉淀磁珠，去除上清，得到高尔基体蛋白73(GP73)抗原硅基磁珠结合物。6)将上一步得到的GP73抗原硅基磁珠结合物加入一定量的保存缓冲液(pH＝7.8±0.05，100mMTris，0.85％NaCl，0.5％BSA，0.1％Proclin300)得到GP73抗原硅基磁珠结合物浓溶液，用于日常保存。