[发明专利]一种基于低场NMR实时检测稀有细胞个数的方法

摘要

本发明公开了一种基于低场NMR实时检测稀有细胞个数的方法，包含以下步骤(1)制备目标稀有细胞悬浮液的标准样本和待测样本；(2)分别加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂，混合均匀后立即分别进行免疫孵育前核磁共振弛豫时间检测；(3)对标准样本和待检样本进行恒温免疫孵育，每隔相同时间间隔进行核磁共振弛豫时间检测；(4)绘制标准样本的免疫孵育时间‑弛豫时间值标准曲线、免疫孵育时间‑弛豫时间改变量标准曲线及孵育细胞数‑弛豫时间改变量最大值曲线；(5)计算待检样本的弛豫时间改变量，依据步骤(4)中绘制的曲线得到待检样本中稀有细胞的浓度。本发明可简便、快速、高特异性、高灵敏度地实时直观检测稀有细胞浓度和个数。

主权项

一种基于低场NMR实时检测稀有细胞个数的方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)样本制备将纯培养的目标稀有细胞，利用有限稀释法以缓冲液进行细胞个数的梯度稀释，制得系列浓度的稀有细胞悬浮液标准样本；对待测生物体液样本进行Ficoll密度梯度离心，获取候选混合细胞群，递经洗涤高心重悬，制得目标稀有细胞悬浮液待检样本；(2)免疫孵育前核磁共振弛豫时间检测取上述标准样本，加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂，混合均匀后立即用低场核磁共振分析仪进行弛豫时间测定，得弛豫时间值T20；取上述待检样本，加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂，混合均匀后立即用低场核磁共振分析仪进行弛豫时间测定，得弛豫时间值T20’；(3)免疫孵育中核磁共振弛豫时间检测取上述加入核磁共振造影剂的标准样本，在恒温下进行免疫孵育，每隔相同的时间间隔，用低场核磁共振分析仪测定一次核磁共振的弛豫时间T2n，其中，n≥1，且n为整数；取上述加入核磁共振造影剂的待检样本，在恒温下进行免疫孵育，每隔相同的时间间隔，用低场核磁共振分析仪测定一次核磁共振的弛豫时间T2n’，其中，n≥1，且n为整数；(4)标准样本的免疫孵育时间‑弛豫时间值标准曲线、免疫孵育时间‑弛豫时间改变量标准曲线及孵育细胞数‑弛豫时间改变量最大值曲线的制作以标准样本的孵育时间t为横坐标，弛豫时间值T2n为纵坐标，对每个细胞浓度梯度绘制免疫孵育时间‑弛豫时间T2n标准曲线；计算标准样本的弛豫时间改变量ΔT2，所述ΔT2＝T2n‑T20，以ΔT2为纵坐标，以免疫孵育时间t为横坐标，对每个细胞浓度梯度绘制免疫孵育时间‑弛豫时间改变量标准曲线，得到核磁共振造影剂与目标稀有细胞的最佳孵育时间；以标准样本的弛豫时间改变量ΔT2最大值为纵坐标，以标准样本中的稀有细胞数个为横坐标，制作孵育细胞数‑弛豫时间改变量ΔT2最大值曲线，以检测本方法的灵敏度；(5)待检样本浓度得出绘制最佳孵育时间下标准样本的细胞数‑弛豫时间改变量标准曲线；计算最佳孵育时间下待检样本的弛豫时间改变量ΔT2test，所述ΔT2test＝T2n’‑T20’，根据ΔT2test结合上述绘制的最佳孵育时间下标准样本的细胞数‑弛豫时间改变量标准曲线，得出待检样本中目标稀有细胞的个数和浓度；所述的低场核磁共振分析仪内设有温度控制设备，通过所述的温度控制设备，控制免疫孵育的恒温温度；所述步骤(2)和步骤(3)中，控制低场核磁共振分析仪的磁场强度为20～25MHz，磁体温度为30～35℃，重复时间3～5s；所述步骤(3)中，在恒温下进行免疫孵育的恒温温度为4～8℃，每次测定核磁共振弛豫时间的时间间隔为10～15min。