[发明专利]一种定位定量检测DNA和RNA中6-甲基氨基嘌呤的方法

摘要

本发明公开了一种定位定量检测DNA和RNA中6-甲基氨基嘌呤的方法。通过对DNA和RNA中6-甲基氨基嘌呤的检测来反映核酸的甲基化水平：6-甲基氨基嘌呤的存在会降低DNA复制和RNA逆转录时的底物活性，在DNA复制和RNA转录过程中，有甲基化位点出现时，将不会发生链延伸；因此，可以通过掺入脱氧核苷三磷酸进行链延伸来达到区分甲基化和非甲基化序列的目的，同时可以对DNA和RNA的特定位点的甲基化水平做出定量评估。本发明可很好地用在DNA和RNA的核苷酸分离中的6-甲基氨基嘌呤分析上，是一种简便的检测DNA和RNA中腺嘌呤甲基化程度的方法。

主权项

一种定位定量检测DNA和RNA中6‑甲基氨基嘌呤的方法，其特征在于，包括如下步骤：1）进行DNA复制反应：向含有2~10 mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、10~50 mM的硫酸铵、1~10 mM的氯化钾、20~100 mM的硫酸镁和20~100 mM的聚乙二醇辛基苯基醚的缓冲溶液中加入DNA聚合酶、引物、三磷酸脱氧核糖核苷酸和DNA模板链，形成DNA复制反应体系，其中，DNA复制反应体系中各物质的浓度：DNA聚合酶为0.2~0.5 U，引物为200~500 nM，三磷酸脱氧核糖核苷酸为100 ~ 400 μM，DNA模板链为0.3 ~ 3 mM；DNA复制反应体系在50~70℃中延伸反应20~60 min；2）进行RNA逆转录反应：向含有2~10 mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、10~50 mM的硫酸铵、1~10 mM的氯化钾、20~100 mM的硫酸镁和20~100 mM的聚乙二醇辛基苯基醚的缓冲溶液中加入RNA聚合酶、引物、三磷酸核糖核苷酸、RNA酶抑制剂和RNA模板链，形成RNA逆转录反应体系，其中，RNA逆转录反应体系中各物质的浓度：RNA聚合酶为0.2~0.5 U，引物为200~500 nM、三磷酸核糖核苷酸为100 ~ 400 μM， RNA酶抑制剂为0.2~0.5 U， RNA模板链为0.2~3 mM；其中，RNA聚合酶和RNA酶抑制剂浓度比为1:1；RNA逆转录反应体系在50~70^oC中延伸反应20~60 min；3）定位定量检测6‑甲基氨基嘌呤：向步骤1）的DNA复制反应体系和步骤2）的RNA逆转录反应体系中加入猝灭剂使延伸反应终止，然后在80~100 ^oC孵育10~30 min，冷却至室温，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以检测出DNA和RNA中6‑甲基氨基嘌呤的数量；根据引物链和其延伸链的相对位置，可以确定DNA和RNA中6‑甲基氨基嘌呤的特定位点。