[发明专利]一种绿盲蝽唾液酶中果胶酶与淀粉酶的体外提取测定方法

摘要

本发明涉及一种绿盲蝽唾液酶中果胶酶与淀粉酶的体外提取测定方法，利用Paraflim膜，采取膜夹营养法提取绿盲蝽唾液酶，并测定绿盲蝽中果胶酶、淀粉酶活性，Paraflim膜法提取绿盲蝽唾液酶利用Paraflim膜、胶卷盒、纱布、橡皮筋、位于两层Paraflim膜间的液体营养介质，利用酶与底物反应的原理，测定绿盲蝽唾液中果胶酶、淀粉酶活性。本方法材料易得，操作简单方便，制作成本低，占空间小，可实现绿盲蝽唾液酶的大量、批量提取，并且绿盲蝽可继续回收利用。

主权项

一种绿盲蝽唾液酶中果胶酶与淀粉酶的体外提取测定方法，其特征在于，具体过程为：步骤a，提取绿盲蝽唾液酶；取3龄绿盲蝽10头，饥饿6h后，置于两端开口的胶卷盒内，顶端覆以两层Paraflim膜，并在两膜间的间隙内用移液枪加入100μL液体营养介质，底端覆以纱布保持通气，重复10次；将装置放入光照培养箱中，待绿盲蝽刺吸取食6h后，移走绿盲蝽，用移液枪收集其唾液混合物，放入1.5mL离心管中；于4℃下，16000g/min离心30min，取上清，‑20℃冰箱中备用；步骤b，测定绿盲蝽唾液酶中果胶酶活性；步骤b1，制作1mg/mL D‑半乳糖醛酸标准曲线；配制1mg/mL D‑半乳糖醛酸的溶液，取10支离心管编号，并按下表1加入各种试剂，在沸水浴中加热5min，冷却后，在分光光度计540nm处以①号试管为标准空白样测定其它试管内溶液的OD值，利用回归分析求得标准曲线方程和相关系数；表1步骤b2，活性测定；取50μL待测酶混合液与100μL的5g/L果胶溶液放入1.5mL离心管中，加入100μL的pH4.8、0.2mol/L的乙酸‑乙酸钠溶液，进行反应，对照组加入50μL不含消化酶的营养液，沸水终止反应；以不含消化酶的营养液为对照；再取反应液100μL加蒸馏水150μL和3g/L显示剂DNS溶液150μL，沸水浴5min，立即冷却，以不含消化酶的营养液空白调零，重复10次，在分光光度计540nm下测定待测酶混合液的OD值；步骤c，淀粉酶活性测定；步骤c1，制作标准曲线；首先配制浓度为5.0mg/mL的麦芽糖标准溶液10mL，测定时分别稀释至0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL；依次取上述溶液40μL分别置于1.5mL离心管中，每管各加入40μL的3g/L显色剂DNS，然后置于沸水浴5min，冰浴冷却后再加入蒸馏水160μL，于分光光度计490nm处测OD值；步骤c2，活性测定：取20μL浓度为1％的淀粉溶液于1.5mL离心管中，加入20μL制备好的待测酶混合液，对照组加入20μL不含消化酶的营养液，混合均匀，于29℃温浴3min后，再加入40μL的3g/L显示剂DNS和160μL蒸馏水，于分光光度计490nm处分别测定两组OD值，重复10次。