[发明专利]基于焦磷酸测序的检测结核分枝杆菌已胺丁醇耐药性的方法

摘要

基于焦磷酸测序的检测结核分枝杆菌已胺丁醇耐药性的方法,包括步骤1，对embB基因进行PCR扩增:针对embB基因306位点设计PCR扩增引物；以标本结核杆菌DNA提取物为模板，对包含embB基因306位点的embB基因进行PCR扩增；扩增结核分枝杆菌embB基因的DNA片段长度165bp，包含embB基因306位点序列为atg;步骤2，对PCR扩增产物进行焦磷酸测序，判断embB基因306位点是否具有突变；其中焦磷酸测序采用SQA模式、核苷酸加样顺序为AGCT。通过多次检验，本发明所示序列的测试引物能高度准确的检测出乙胺丁醇embB基因耐药突变位点，可以快速筛查结核分枝杆菌耐药株，有助于实现对感染耐药结核分枝杆菌患者的早发现、早诊断和早治疗。

主权项

基于焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌已胺丁醇耐药性的方法，其特征在于包括以下顺序步骤：步骤1，对embB基因进行PCR扩增；包括针对embB基因306位点设计PCR扩增引物，以标本结核杆菌DNA提取物为模板，对embB基因进行PCR扩增，扩增使用的PCR引物在embB基因306位点序列是高度保守和唯一的，扩增结核分枝杆菌embB基因的DNA片段长度为165bp，包含embB基因306位点序列:atg所用的扩增embB基因的PCR引物及其序列如下：F:CGTGGTGATATTCGGCTTCCTR:AGGTTGTAATACCAGCCGAAGG其中F引物5端用生物素标记；F为PCR上游引物；R为PCR下游引物。步骤2，对PCR扩增产物进行焦磷酸测序，判断embB基因306位点是否具有突变；其中焦磷酸测序采用SQA模式、核苷酸加样顺序为AGCT；所述焦磷酸测序检测步骤具体如下（1）PCR产物固定：在PCR板中放入40μL的PCR扩增产物，再分别加入36μL的结合缓冲液和4μL链亲和素包被的磁珠；将PCR板放在涡旋振荡器上常温振荡20分钟，使PCR产物固定在磁珠上；（2）单链模板的纯化：打开真空泵，将真空样品转移器移到PCR板中，抓取结合PCR产物的磁珠，检查是否大部分磁珠都被吸附在了真空样品转移器上；再将真空样品转移器放入70%乙醇中轻微振荡5秒，然后移到变性缓冲液中抽吸5秒，使DNA变性以得到纯化的单链DNA模板，最后移到洗涤缓冲液中清洗5‑10秒，洗涤未固定的单链DNA，从而得到作为测序模板的单链DNA；（3）引物杂交：先在焦磷酸测序微孔板各孔中加入退火缓冲液50μL，再加入具有表1所示序列测序引物；测序引物的最低要求浓度为1μmol/L，最高浓度为0.2mmol/L；再将真空样品转移器从PCR板移入焦磷酸测序微孔板，关闭真空泵，将已纯化好的单链DNA模板与序列测序物引物混和，在80℃下变性2分钟，然后冷却至室温，使引物与模板退火杂交；测序引物的序列如下所示：GTGGTCGGCGACTCG（4）焦磷酸测序：依次在测序仪试剂仓中加入酶、底物和4种dNTPs，选用SQA检测模式、以A、G、C、T顺序循环加样16次的碱基加入顺序进行测序反应；通过CCD光学系统对每次加样后产物进行检测，以获得特异的检测峰，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息；（5）将焦磷酸测序结果与结核分枝杆菌标准株的embB基因306位点序列相比较，即可准确的判断出结核分枝杆菌embB基因306位点是否发生耐药突变，embB306突变被视为结核分枝杆菌耐已胺丁醇(EMB)和耐多药结核病的分子诊断标记，进一步判断检测结核分枝杆菌具有耐已胺丁醇(EMB)和耐多药性。