[发明专利]一种基于溴脱氧尿嘧啶核苷掺入的卷烟烟气增殖毒性评价方法

摘要

一种基于溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）掺入的卷烟烟气细胞增殖毒性评价方法，其特征在于：包括以下步骤：1）溶液的配制，2）细胞接种，3）卷烟烟气染毒及BrdU掺入，4）BrdU掺入量的测定，5）结果与分析。本发明具有以下特点：（1）本发明通过烟气粒相物萃取液和烟气气相物吸收液的制备，可分别考察烟气粒相物、气相物的细胞毒性。（2）通过细胞适用性验证步骤，本发明可能适用于多种贴壁培养细胞，可用于考察卷烟烟气对不同细胞系的细胞增殖毒性。（3）通过BrdU掺入时间和细胞膜通透液浓度的优化提高检测灵敏度。（4）并通过卷烟烟气染毒浓度的优化，确定了最佳染毒浓度，以获得最佳剂量效应曲线。此外，本测定方法还具有操作快速简便、灵敏性高、结果稳定的优点。

主权项

一种基于溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）掺入的卷烟烟气增殖毒性评价方法，其特征在于：该方法是基于BrdU掺入原理，通过检测不同浓度卷烟烟气染毒下，细胞DNA合成的BrdU掺入量，利用BrdU抗体对掺入DNA的BrdU的特异性识别进行检测，进而考察评价卷烟烟气的增殖毒性，具体步骤如下：1）溶液的制备：（1）磷酸盐缓冲液PBS：用磷酸二氢钾和磷酸氢二钠配制（pH=6.7）；（2）封闭液：有PBS缓冲液配制1% BSA（质量百分比）作为封闭液；（3）HRP酶标记的BrdU抗体： ‑20 ℃保存，使用封闭液对抗体进行稀释配制；（4）细胞固定液：4% 多聚甲醛或70%乙醇；（5）2M的盐酸HCl溶液：使用去离子水配制2M的HCl溶液；（6）细胞膜通透液：曲拉通100（Triton‑100），使用PBS溶液稀释配制；（7）0.1M四硼酸钠（Na2B4O7）：用PBS溶液配制；（8）HRP酶显色底物：3,3’,5,5’‑四甲基联苯胺（TMB）溶液；（9）卷烟烟气染毒溶液的制备：包括烟气粒相物萃取液、烟气气相物吸收液；（10）细胞培养基：溶剂为RPMI‑1640 培养基，其中胎牛血清的体积百分比为10%，L‑谷氨酰胺的浓度为2 mM，青霉素的浓度为100 IU/ml，链霉素的浓度为100μg/ml；2）细胞样本的处理：（1）细胞接种：选用贴壁细胞，向96孔板（除最外周36个孔）中分别接种含有最佳接种密度细胞个数的100μl细胞悬液，于37 ℃、5% CO2条件下培养24 h；（2）卷烟烟气染毒及BrdU掺入：细胞培养24 h后，吸去培养液，96孔板（除最外周36孔）每列6孔为一组分别设置为空白对照组和卷烟烟气染毒组，空白对照组中每孔加入 100μl细胞培养基、卷烟烟气染毒组中每孔加入100μl卷烟烟气染毒溶液，于37 ℃、5% CO2 条件下培养22 h，每孔加入10μl的BrdU染料，继续孵育；（3）BrdU掺入量的测定：a、吸除培养板中的溶液，每孔加入100μl 的4%多聚甲醛或70%乙醇，于室温下固定20‑30分钟；b、吸除溶液后，每孔使用200μl的PBS溶液洗涤3次，每次不少于10分钟；c、每孔加入100μl 的2MHCl，室温下放置15分钟；d、每孔使用200μl的PBS溶液洗涤3次，每次不少于10分钟；e、每孔加入100μl 0.1M四硼酸钠（Na₂B₄O₇），室温下放置15分钟；f、每孔使用200μl的PBS溶液洗涤3次，每次不少于10分钟；g、每孔加入100μl的0.1%Triton 100溶液进行细胞膜通透，反应1‑2min；h、为减少抗体的非特异性吸附，每孔加入100μl的1%BSA中封闭1h，i、每孔加入100μl的HRP酶标记的BrdU抗体，4度过夜；j、每孔使用200μl的PBS溶液洗涤3次，每次不少于10分钟；k、加入HRP酶常用TMB显色底物进行显色反应，并在450nm处检测相应吸光度值；（4）数据处理吸光值A ：A = A450 nm A_{空白对照组}=6个平行孔的吸光度平均值A_染毒组=6个平行孔的吸光度平均值细胞增殖抑制率（%）= 1‑A_染毒组/ A_{空白对照组}。