[发明专利]一种组织工程化搏动组织的构建方法

摘要

本发明涉及生物医学工程技术和再生医学领域，具体涉及一种组织工程化搏动组织的制备方法。本发明将棕色脂肪来源的干细胞诱导为窦房结样细胞，种植于胶原海绵上，在体外构建组织工程化的窦房结样搏动组织。本发明获得了一种具有起搏特性的组织工程化组织，为筛选心律失常药物等研究提供了一种组织模型，为治疗病态窦房结综合征、房室传导阻滞所致心律失常疾病带来了希望。

主权项

一种组织工程化搏动组织的构建方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：A、起搏细胞的获取将小鼠、大鼠的肩胛间棕色脂肪组织，利用二次消化法、II型胶原酶，分离出棕色脂肪来源的干细胞；具体步骤如下：棕色脂肪0.1‑1克，置于4℃ PBS中清洗，移入离心管中，加入0.2‑2ml 0.1%的II型胶原酶高糖DMEM中，剪碎；将剪碎的脂肪组织移至另一离心管中，加入5‑20ml的0.1%的Ⅱ型胶原酶高糖DMEM，37℃消化45 min，期间反复震荡混匀；3000rpm离心1‑3分钟，吸上清用100目滤网过滤，收集第一次滤液；再向上述离心管中加入1‑10ml的0.1%的Ⅱ型胶原酶高糖DMEM，37℃消化20 min，期间反复震荡混匀；3000rpm离心1分钟，吸上清用100目滤网过滤，收集第二次滤液；将第一次滤液和第二次滤液合并入另一离心管中，加入1‑5ml 10%的FBS/DMEM，1500rpm离心3分钟，吸去上层漂浮的白色脂肪；所述的Ⅱ型胶原酶高糖DMEM中还含有1%BSA；起搏细胞的诱导：吸弃上清，加入15%的FBS/DMEM，取细胞沉淀成细胞悬液种于35mm培养皿中或6孔板中，每皿/孔接种7.0×106个细胞，加适量15%的FBS/DMEM培养基，放于37℃细胞培养箱培养，每3天换一次液；在培养过程中，加入80ng/ml 的Dikkopf‑1，培养至10‑14天，每2‑3天换一次液；鉴定起搏细胞；B、起搏细胞‑胶原海绵复合体的构建胶原海绵的准备：将胶原海绵剪成0.8×0.6×0.2 cm大小，消毒备用；起搏细胞的准备：将原代培养13天的脂肪来源的干细胞制成细胞悬液，调至细胞密度为1.0×107个/ml；起搏细胞‑胶原海绵复合体的构建：将起搏细胞均匀接种于胶原海绵上，总量100μl，静置1小时后，用15%的FBS/DMEM培养基培养7天。